4.1 Hasta verilerinin ve Örneklerin Toplanması
Şubat 2015-Ağustos 2015 tarihleri arasında Ege Üniversitesi Tıp fakültesi hematoloji polikliğinde MDS tanısı ile izlenen yada yeni tanı konulan 18 yaş üzerindeki destek tedavisi ile yada klasik kemoterapi dışındaki tüm tedavi yöntemleri ile takip edilen hastalar çalışmaya dahil edildi. Hastalarının poliklinik takip dosyasında tanı esnasındaki ve son kontrollerinde bakılan; hemogram, biyokimya (LDH-Ferritin-Albümin-Globülin) değerleri, kemik iliği aspirasyon ve patoloji ( blast oranı, selüleritesi, retiküler lif derecesi) sonuçları, karyotip ve FISH sonuçları, EPO düzeyi kaydedildi. Bu tetkikler rutinde istenmiş olduğundan ek tetkik yapılması gerekmemiştir. Almış olduğu tedaviler ve transfüzyon sıklıkları belirlendi. Çalışmaya katılan her olgu “Gönüllü Olur Formu” nu imzalayıp, çalışmaya katılmayı kabul etti. EDTA’ lı tüplere 3’ er ml olmak üzere toplam 2 tüp kan örneği alındı. Periferik kan örnekleri son transfüzyondan yaklaşık 1 ay sonra, daha sık transfüzyon ihiyacı olan hastalarda ise transfüzyondan hemen önce alındı. Çalışma protokolümüz, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu tarafından 02.03.2015 tarih ve 15-2.1/13 nolu karar ile onaylandı.
4.2 Kandan DNA izolasyonu
Polimorfizm tayinindeki ilk aşama, periferik kandan cam lifli filtreye nükleik asit bağlama metoduna göre gerçekleştirilen DNA izolasyonudur. Çalışmalar, ticari olarak satılan DNA izolasyon kiti protokolüne göre gerçekleştirildi. Protokol, aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır. DNA izolasyonu Roche Magnapure cihazında, cihaza uygun Roche kitlerle gerçekleştirildi.
1. EDTA’ lı tüplere alınan kandan 200 μl alınıp, üzerine 200 μl bağlanma çözeltisi ve 40 μl Proteinaz K ilave edilir; pipetle resüspanse edilerek homojenizasyon sağlandı.
2. Tüpler, önceden 72°C’ ye ayarlanan kuru ısı bloğunda 10 dakika inkübasyona bırakıldı. 3. İnkübasyon sonunda, karışım üzerine 100 μl izopropanol eklenir ve pipet ile iyice karıştırıldı.
4. Eppendorf tüp içinde bulunan örneğin tamamı, ‘collection’ tüp içine yerleştirilmiş filtreli tüpün içine pipetlendi.
5. 8.000 revolutions per minute (rpm) de 1 dakika santrifüj edildi. 6. Santrifüj sonrasında filtreli kısım yeni bir ‘collection’ tüpüne aktarıldı. 7. Filtreli tüpün üzerine 500 μl inhibitör uzaklaştırıcı çözeltisi eklendi. 8. 8.000 rpm’ de 1 dakika santrifüj edildi.
9. Santrifüj sonrasında filtreli kısım yeni bir ‘collection’ tüpüne aktarıldı. 10. 500 μl yıkama çözeltisi eklenerek, 8.000 rpm’ de 1 dakika santrifüj edildi.
11. Filtreli tüpler yeni collection tüplere aktarılıp ve üzerlerine ikinci kez 500 μl yıkama çözeltisi eklendi.
12. 8.000 rpm’ de 1 dakika santrifüj edildi.
13. Santrifüj bittikten sonra, tüplerin alt kısmında biriken süpernatant uzaklaştırılıp ve tekrar 8.000 rpm’ de 10 saniye santrifüj edildi.
14. Filtreli tüpler, Eppendorf tüpün içine yerleştirilip 72°C’ ye ayarlanmış kuru ısı bloğunda ısıtılmış elüsyon çözeltisinden 200 μl ilave edilerek 8.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. 15. Santrifüj sonrasında filtreli tüp atıldı. Eppendorf tüpte geri kalan çözelti genomik DNA’ elde edildi.
DNA’ ları cam lifli filtreye nükleik asit bağlama yöntemine göre izole edilip; miktarları ve saflıkları spektrofotometrik olarak ölçülen olgulara ait DNA’ lar bu çalışmada kullanıldı.
4.3 Genler ve SNP’ ler
Bu çalışmada, polimorfizm bakılacak 4 gene ait SNP TET2 rs763480 (A/T dönüşümü intron varyant), ASXL1 rs2208131 (A/G dönüşümü intron varyant), IDH1: rs11554137 (C/T dönüşümü sessiz mutasyon) IDH2: rs267606870 (C/G dönüşümü missense mutasyon), rs121913503 (G/A dönüşümü missense mutasyon) şeklindedir.
IDH2 rs121913503 R172K, R42K, R120K pozisyonunda arjinin lizin değişimine, IDH2 rs267606870 R140G, R88G, R10G pozisyonda arjinin glisin değişimine, IDH1 rs11554137 G105G pozisyonunda glisin-glisin değişimi sessiz mutasyona neden olurken TET2 ve ASXL1 amino asit değişikliği yapmamaktadır.
4.4 Gerçek zamanlı PCR Aşaması
Gerçek zamanlı PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon esnasında yapılmaktadır. PCR ürünlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır. Böylece sonuçlar anında alınmakta, kontaminasyon riski azalarak tüm işlemler sıcaklık döngüleri başlayınca otomatik olarak devam etmektedir. ABI 7500 Fast Real Time PCR sisteminde, sonuçların güvenirliliği oldukça yüksektir. Bu cihazda, amplifikasyon ürünlerinin artışı eş zamanlı olarak takip edilebilmektedir.
Bu çalışmada polimorfik bölgenin çoğaltılması için ileri ve geri olmak üzere iki primer ve aleller arasındaki farklılığı ortaya çıkarmak için de 3’ucunda küçük oluk bağlayıcı (MGB) floresan olmayan söndürücü ile 5' ucunda FAM (Allel 1 için spesifik) veya VIC (Alel 2 için spesifik) adı verilen 5' ve 3'uçlarından florokrom ile işaretli iki TaqMan ® MGB prob'unu içeren TaqMan SNP genotyping assay (AppliedBiosystems, Foster City, CA) kullanılarak ABI 7500 Fast gerçek-zamanlı PCR cihazında tespit edildi. PCR reaksiyonları ve döngü koşulları üretici firmanın talimatlarına göre gerçekleştirildi.
PCR gerçekleştikten sonra allelik diskriminasyon (allel ayırt etme) için öncelikle, verileri otomatik olarak toplamak üzere Sekans Saptama Sistemleri yazılımı (“Sequence Detection Systems”, SDS 2,0) kullanıldı. Bu yazılım sayesinde her bir örnekte meydana gelecek floresan sinyalinin artışına göre genotiplendirme yapılıp ve bulgular üreticinin kılavuzuna göre yorumlandı. Olgular, FAM’ da floresan artışı olduğunda polimorfik
(Homozigot mutant), VIC’ te artış olduğunda, yabanıl tip (yabanıl tip), her ikisinde de artış olduğunda heterozigot genotip olarak değerlendirildi.
4.4.1 PCR Reaksiyon Hacmi 96- kuyucuklu plaka TaqMan Genotyping PCR Reaksiyon Karışımı (2✕) 5.00 µL 20✕çalışma stok solüsyonu:
(SNP Genotipleme Testi) 0.50 µL DNA/Su/ Pozitif Kontrol 4.50 µL
Toplam Hacim 10 µL
4.4.2 PCR Koşulları
AmpliTaq Gold Enzyme
Aktivasyonu
PCR (40 döngü)
Süre Denatürasyon Bağlanma/Uzama
4.5 İstatistik
Dağılım testleri ile (Saphiro ve/veya Kolmogorov-Smirnov testi) nümerik parametrelerin dağılımının normal olup olmadığı test edildi. Normal dağılıma sahip sürekli değişkenler ortalama±standart sapma şeklinde, normal dağılıma uygun dağılmayan değişkenler ise medyan/aralık şeklinde verildi Bağımsız iki grup karşılaştırmalarında normal dağılım varsayımı sağlanmadığı için Mann Whitney U testi, ikiden fazla grup karşılaştırmalarında Kruskal Wallis testinden yararlanıldı Nitel verilerin karşılaştırmalarında ki-kare testi kullanılmıştır.
Allellerin genotiplere dağılımı ve bu dağılımın beklenen değerlerle uyumunun (Hardy- Weinberg dengesi) incelenmesinde ki-kare testi uygulandı. Ki kare testinde p>0.05 dengede kabul edildi. Genotiplerin diğer parametrelerle karşılaştırılması için Ki-kare testi kullanıldı.
Genel sağkalım hastalığın tanısından ölüme kadar olan süre ya da son kontrol zamanı hesaplanıp Kaplan Mayer ve long rank testi kullanılarak karşılaştırıldı. Progresyonsuz sağkalım tanıdan lösemik transformasyon veya ölüme kadar olan süre olarak hesaplandı. Sonuçlar, anlamlılık p<0,05 düzeyinde ve %95’lik güven aralığında değerlendirilmiştir. İstatistiksel değerlendirme için Statistical Packages of Social Sciences, SPSS for Windows, Version 20.0, Chicago, IC, USA (SPSS 20) programı kullanılıştır.