DISCUSSION ET
PERSPECTIVES
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PARTIE III : DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Plusieurs articles récents ont confirmé que les Pim kinases sont des cibles thérapeutiques potentiellement importantes dans différents types de cancer. La délétion de Pim1 dans des cellules humaines ou murine de cancer de la prostate diminue leur survie, leur prolifération et leur tumorigénèse (Wang et al., 2012). Néanmoins, c’est en onco-hématologie que le ciblage thérapeutique de ces kinases parait le plus prometteur (Garcia et al., 2014). Deux inhibiteurs développés par les firmes AstraZeneca (AZD 1208) et Novartis (LGH447) sont actuellement testés dans des essais cliniques de phase 1 dans le myélome multiple, les lymphomes et les leucémies aiguës myéloïdes. Contrairement aux inhibiteurs précédents qui présentaient une efficacité médiocre contre Pim2, ces deux molécules sont efficaces contre les 3 Pim kinases avec des Ki inférieurs au nM et même proches du pM pour les composés développés par Novartis (Garcia et al., 2014). Néanmoins, la sensibilité des cellules cancéreuses à ces inhibiteurs est très variable et très imparfaitement corrélée au niveau d’expression des Pim kinases dans les cellules leucémiques (Keeton et al., 2013). Il est donc nécessaire de comprendre l’action de ces kinases constitutivement actives pour utiliser efficacement ces inhibiteurs en thérapie anti-leucémique.
Les résultats obtenus au cours de ma thèse ont permis de mettre en évidence la forte instabilité des trois isoformes de Pim2, dont seule la transcription parait régulée. Ces trois isoformes sont dégradées par le protéasome mais mes résultats indiquent que cette dégradation est constitutive. Par ailleurs, l’extrémité N-terminale semble moduler la stabilité de la protéine puisque l’isoforme la plus longue est environ 10 fois plus stable que les deux autres isoformes. Cette différence de stabilité n’est pas due à une localisation subcellulaire différente et la dégradation ne semble pas impliquer le système N-end rule. Par ailleurs, Pim2 semble dégradée par le protéasome sans ubiquitination préalable et pourrait donc rejoindre la liste des proto-oncogènes et des suppresseurs de tumeurs dégradés par le protéasome sans ubiquitination (Jariel-Encontre et al., 2008). La confirmation de cette hypothèse passera par la purification des trois isoformes et leur test de dégradation par le protéasome 20S et le protéasome 26S isolé. Les résultats publiés pour différentes protéines dégradées par le protéasome sans ubiquitination préalable montrent que l’addition d’un tag, pour faciliter la purification de la protéine, modifie souvent considérablement la stabilité de la protéine. Il sera donc nécessaire de purifier les formes endogènes de Pim2. Un travail est en cours à partir
155 d’extraits de cellules de myélome. Nous avons montré que les formes de Pimβ qui s’accumulent dans les cellules de myélome traitées par des inhibiteurs du protéasome sont catalytiquement actives et que l’un des inhibiteurs de Pimβ actuellement testé en clinique, l’AZD1β08, présente des effets additifs avec les inhibiteurs du protéasome comme le bortezomib classiquement utilisé dans le traitement de cette pathologie. La combinaison des deux inhibiteurs devrait donc être envisagée, d’autant plus que l’effet limité de l’inactivation des trois Pim kinases chez la souris laisse supposer que la toxicité des inhibiteurs des Pim kinases devrait être limitée.
Au cours de ma thèse, j’ai mis en place une technique de purification et d’analyse globale des phosphopeptides par spectrométrie de masse pour analyser les effets de l’inactivation de Pimβ dans les cellules de LAM. La technique que j’ai développée est fiable et reproductible et elle est maintenant régulièrement utilisée sur la plateforme de protéomique de l’Université Paris Descartes. Elle permet d’analyser plusieurs milliers de résidus phosphorylés à partir de quelques milligrammes d’extraits cellulaires totaux. Cette analyse, couplée à un marquage SILAC qui n’avait pas encore été utilisé sur la plateforme, est très précise permettant ainsi de quantifier des variations de phosphorylation relativement faibles. Elle m’a permis de mettre en évidence la diminution très précoce après l’inactivation de Pimβ de la phosphorylation de plusieurs substrats directs ou indirects de la voie mTORC1 et de plusieurs protéines impliquées dans la prolifération cellulaire et en particulier la phase M du cycle cellulaire. Les différentes analyses effectuées au cours de ma thèse ont donc permis de positionner Pim2 comme un régulateur de mTORC1, contrairement à l’activité de contrôle de la traduction en parallèle de mTORC1 qui avait été envisagée préalablement (Tamburini et al., 2009a). Lorsque nous réalisions la vérification des résultats de notre analyse du phosphoprotéome, une publication a validé cette théorie puisque TSC2, qui est un régulateur négatif de mTORC1 situé en aval de PI3K/Akt, a été identifié comme un nouveau substrat direct de Pim2 qui le phosphoryle sur la S1798 (Lu et al., 2013) et qui active ainsi la voie mTORC1. Par ailleurs, la phosphorylation activatrice de PLK1 qui contrôle de nombreux aspects de la mitose est diminuée de presque 50%. L’importance relative de ces deux processus dans l’induction de l’apoptose des cellules est difficile à établir. Il a été démontré au laboratoire que les inhibiteurs compétitifs de mTOR provoquent l’apoptose de ces cellules (Chapuis et al., 2010; Willems et al., 2012) mais ces inhibiteurs bloquent les deux complexes mTORC1 et mTORCβ. La rapamycine, qui par ailleurs peut aussi conduire à l’inhibition du complexe mTORCβ lors d’incubations prolongées, n’inhibe que partiellement mTORC1 et ne diminue que faiblement la phosphorylation de 4E-BP1 (Tamburini et al., 2009a). Il a été récemment
156 rapporté qu’Akt, dont l’activation nécessite le complexe mTORC2, phosphoryle PLK1 sur la sérine 99 et que cette phosphorylation est nécessaire pour son activité lors de la mitose (Kasahara et al., 2013). D’un autre coté, il a été rapporté que PLK1 pouvait aussi activer mTORC 1 dans les cellules de LAM (Renner et al., 2010). J’ai observé que les inhibiteurs de PLK1 comme le BI2536 sont très toxiques dans ces cellules. En effet, l’utilisation du BIβ5γ6 aboutit dans nos mains à une extinction complète de la phosphorylation de la S65 de 4EBP1 sous β4h environ et à 90% d’apoptose en 48h. Il est donc difficile de dire d’après ces données qui montrent l’interconnexion de ces effets, si une de ces voies, mTORC1 ou PLK1, joue un rôle majeur pour relayer les actions anti-apototiques de Pim2. Mes résultats montrent une association de Pim2 avec PLK1. Pour analyser cette association, j’ai développé un système halotag pour Pim2 qui me permet de réaliser des expériences de localisation par fluorescence, tout en gardant la possibilité d’utiliser différents anticorps pour révéler d’autres protéines comme PLK1 ou Chk1. Pour ces expériences, j’ai utilisé des cellules adhérentes de type Hela avec lesquelles il est beaucoup plus facile de suivre les différentes phases du cycle cellulaire qu’avec des cellules en suspension et j’ai synchronisé les cellules. Mes résultats montrent une association de PLK1 avec Pim2 tout au long de la mitose avec en particulier une forte colocalisation lors de la cytodiérèse, où la majeure partie des deux protéines parait localisée au niveau de l’anneau de constriction (corps de Fleming). Un article qui vient tout juste d’être publié montre une colocalisation semblable de PLK1 et de Pim1 à l’anneau de constriction dans des cellules de cancer de la prostate (van der Meer et al., 2014). Les cellules qui prolifèrent n’expriment pas toutes des Pim kinases et l’inactivation des trois Pim kinases n’a qu’un effet limité chez la souris. On peut donc supposer que l’action des Pim kinases lors de la mitose doit être assurée par une autre kinase dans la plupart des autres cellules. Il est tentant de penser que cette kinase pourrait être Akt dont il vient d’être montré qu’il peut phosphoryler PLK1 sur la sérine 99. Néanmoins, cette régulation est complexe puisque seule PLK1 isolée de cellules en mitose peut être phosphorylée par Akt suggérant soit un mécanisme de « priming » soit la co-purification avec PLK1 d’un co-facteur ou d’une kinase impliqué dans la phosphorylation de la S99. Le test kinase qui nous a permis d’identifier la phosphorylation de la T149 devra être reproduit en utilisant de la kinase PLK1 isolée à partir de cellules en mitose, comme décrit par Kasahara, pour contrôler que Pimβ n’est pas aussi capable comme Akt de phosphoryler la sérine 99 (Kasahara et al., 2013). Par ailleurs, il sera nécessaire de produire un anticorps reconnaissant la thréonine 149 phosphorylée pour analyser le rôle de ce processus dans le mécanisme d’action des Pim kinases.
157 Le délai observé entre l’inactivation de Pimβ par ShARN (environ 8H) et le début du blocage du cycle et de l’apoptose après 3 jours est également intriguant, puisque des actions inhibitrices nettes sur la voie mTORC1 et sur la phosphorylation de PLK1 sont visibles dès 1βH de traitement. L’observation de la diminution de la phosphorylation de nombreuses protéines impliquées dans la mitose et la réparation de l’ADN, nous permet d’envisager que ce délai pourrai être dû à une accumulation de défauts mitotiques. Ces données sont également soutenues par les résultats de Zirkin et al., qui ont montré que Pim2 agit comme un activateur de la voie de réponse aux dommages à l’ADN induits sous UV dans les cellules d’ostéosarcome UβOS. Selon eux, la surexpression de Pimβ dans les cellules irradiées diminue l’accumulation de gHβAX en réponse aux cassures double-brins et favorise la réparation (Zirkin et al., 2013). Au cours de tests très préliminaires, j’ai observé une augmentation de l’expression de Pimβ dans les cellules Molm irradiées à 5 grays, sans toutefois empêcher l’accumulation de gHβAX. Toujours selon Zirkin et al., cette accumulation de Pim2 pourrait être liée aux sites de fixation de NFkB sur le promoteur, qui interviendrait sur la transcription de Pimβ seulement en réponse à l’exposition aux UV. Pim2 pourrait favoriser la réparation des dommages à l’ADN dans les cellules corrélant également avec son intervention sur Chk1. Une action possible de Pim2 sur la réparation de l’ADN devrait être prise en considération.
Sa localisation subcellulaire et son implication au cours de la mitose n’en sont que plus intéressantes. Toutes ces données illustrent l’intérêt croissant des Pim kinases dans différents types de cancer et révèlent de multiples potentiels oncogéniques de ces kinases, dont l’inhibition fournira à terme, nous l’espérons, un espoir thérapeutique.