Müşteri Memnuniyeti ve Davranışsal Niyet İlişkisi

As proteínas constituintes da seda da teia da aranha N. clavipes foram submetidas à

análise proteômica com estudos de modificações pós-traducionais. Essa seda apresenta elevada resistência, extensibilidade e elasticidade que caracterizam a teia orbital e o frame. Os fios de seda que constituem a teia orbital e o frame foram coletados e armazenados em frascos individualmente. A teia orbital foi coletada com o auxílio de uma folha de papel mais resistente “tipo cartolina”. Os fios de seda coletados foram limpos com o auxílio de uma pinça para a retirada de partículas, restos de insetos, folhas e galhos aderidos na seda evitando dessa forma uma contaminação da amostra. E com essa limpeza acabou ocorrendo uma perda parcial de fibras. Após a limpeza, tanto os fios de seda da teia orbital quanto os do frame foram pesados em frascos individuais sendo obtidos 300 mg de fios de seda da teia orbital, e 450 mg de fios de seda do frame.

Com a finalidade de se obter informações sobre as características estruturais da superfície dos fios da seda, análises de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foram realizadas mostrando a ultraestrutura dos fios da seda constituintes do frame e da teia orbital (Figuras 33 e 34). As fibras parecem ser constituídas de vários fios entrelaçados entre si, que formam estruturas em camadas sobrepostas; também é possível notarmos, o que pode ser uma emenda dos fios (Figura 34B), realizado pela aranha; e ainda podemos visualizar a presença de estruturas macroporosas conectadas entre si (Figura 34D).

120 Figura 33. SEM – Microscopia eletrônica de varredura da seda do “frame” da teia da aranha N. clavipes. (A) seda coletada constituída pelos fios dos raios do “frame” enrolados; (B-D) ultraestrutura

121 Figura 34. SEM – Microscopia eletrônica de varredura da seda da teia orbital da aranha N. clavipes.

(A) seda coletada constituída pelos fios dos raios e da espiral de captura da teia orbital; (B-D) ultraestrutura dos fios da seda em diferentes pontos, destacando a presença de macroporos.

Um dos aspectos técnicos que contribuiu para o sucesso na análise dos fios de seda já pronta (madura), a partir do material obtido diretamente da teia, foi a solubilização dos fios de seda em tiocianato de lítio. E para demonstrar a solubilidade da seda durante a preparação da amostra, resultados de microscopia eletrônica de varredura revelaram a ultraestrutura da seda durante o processo de dissolução dos fios em solução saturada de tiocianato de lítio (Figura 35). A dissolução completa da seda após 60 minutos de contato com essa soluçao mostrou a homogeneidade da amostra que foi preparada para a análise proteômica.

122 Figura 35. SEM - Microscopia eletrônica de varredura da seda da teia da aranha N. clavipes. (A-D)

mostra o padrão de dissolução da seda, em diferentes pontos, na presença de solução saturada de tiocianato de lítio (LiSCN hidratado 38M).

Após a extração das proteínas, as mesmas foram quantificadas pelo método de Bradford, e submetidas à eletroforese bidimensional - 2-DE (n=8), apresentando um alto grau de identidade entre os géis analisados de cada amostra individualmente. Como as proteínas constituintes da seda de aranhas são descritas na literatura com elevado peso molecular (acima de 200 kDa), optou-se por realizar a 2-DE em um gel SDS-PAGE com gradiente de 7-10%, e também utilizamos fitas Immobilized pH 7-10 gradiente não linear para uma melhor resolução

do perfil proteico. A figura 36 mostra o perfil da eletroforese bidimensional da seda do frame, sendo possível visualizar um total de 4 spots com MW acima de 250 kDa, e pI no intervalo de

pH 9 a 10 (gradiente não linear); enquanto a figura 37 mostra o perfil da eletroforese bidimensional da seda da teia orbital, sendo possível visualizar um total de 6 spots com MW

123 Figura 36. Perfil eletroforético da 2-DE da seda do “frame” da aranha N. clavipes.

124 Figura 37. Perfil eletroforético da 2-DE da seda da teia orbital da aranha N. clavipes.

Todos os spots foram excisados dos géis e submetidos à digestão enzimática utilizando-

se 8 diferentes enzimas proteolíticas como tripsina, quimiotripsina, pepsina, Glu-C/V8 protease, proteinase 10, proteinase K, Asp-N protease e subtilisina. Após a digestão enzimática, as amostras foram analisadas por espectrometria de massas. A tabela 11 mostra a identificação de todos os spots analisados, sendo identificadas as proteínas espidroína-1 (spots 1, 2, 3 e 4) e

espidroína-2 (spots 3 e 4) na seda do frame; e as proteínas da seda flageliforme (spots 1 e 2) e

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foram identificadas nos mesmos spots (3 e 4), sugerindo uma coexistência das duas formas nas

fibras, associadas talvez por cross-links.

Tabela 11. Proteínas identificadas na seda da aranha N. clavipes através da digestão in-gel

dos spots oriundos da 2-DE.

Spots Código de

Acesso Proteína MW (kDa) Exp. Calc. MW (kDa) da sequência * % cobertura

Proteínas identificadas na 2-DE da seda do frame

1, 2, 3 e 4 P19837 Espidroína-1 > 250 61.21 98.12

3 e 4 B5SYS7

P46804 Espidroína-2 > 250 69.03 91.02

Proteínas identificadas na 2-DE da seda da teia orbital

1 e 2 O44358

O44359 Proteína da seda flageliforme > 250 74.33 96.14 3, 4, 5 e 6 B5SYS5

B5SYS6 P19837

Espidroína-1 > 250 86.77 98.94

* MS/MS: Todas as sequências peptídicas são mostradas no material suplementar, apêndices A - Tabelas S1, S2, S3 e S4.

A proteína da seda flageliforme foi identificada com os códigos de acesso GenBank ID O44358 (N-terminal) e O44359 (região central e C-terminal) apresentando uma cobertura da sequência de 96.14%; a espidroína-1 foi identificada com os códigos de acesso GenBank ID B5SYS5 (N-terminal - espidroína-1A), B5SYS6 (N-terminal - espidroína-1B) e P19837 (região central e C-terminal) apresentando uma cobertura da sequência de 98.94%; nas aranhas do gênero Nephila existem evidências da ocorrência de dois genes que codificam a proteína

espidroína-1, sendo denominado então de espidroína-1A e espidroína-1B (Rising et al., 2007; Gaines et al., 2008); e a espidroína-2 foi identificada com os códigos de acesso B5SYS7 (N- terminal) e P46804 (região central e C-terminal) apresentando uma cobertura da sequência de 91.02%. Todas as sequências foram identificadas a partir de dados de sequências parciais depositados nos bancos de dados (Xu et al., 1990; Hinman et al., 1992; Beckwitt et al., 1994; Hayashi et al., 1998; Gaines et al., 2008). Valores de massas moleculares teóricos foram determinados para espidroína-1 de 86.77 kDa, para espidroína-2 de 69.03 kDa e para proteína da seda flageliforme de 74.33 kDa. Estudos demonstram que as espidroínas constituintes das fibras da seda apresentam MW em torno de 250-300 kDa após serem expelidas pelo ducto de fiação formando as fibras sólidas (Sponner et al., 2005; Ayoub et al., 2007; Hagn et al., 2010).

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No entanto, os elevados valores observados para as massas moleculares mostradas na 2-DE (Figuras 36 e 37) e tabela 9 podem ser devido à existência de cross-links ou glicosilação,

modificação conhecida por reduzir a mobilidade das proteínas no gel; ou/e ainda por outras modificações pós-traducionais que também possam influenciar o peso molecular ou o comportamento das espidroínas no gel (Thiel et al., 1994; Michal et al., 1996; Augsten et al., 2000). Isso será melhor discutido adiante neste texto.

Considerando-se a grande quantidade de fragmentos peptídicos que foram gerados na identificação e sequenciamento das proteínas oriundas da 2-DE da seda, e para que a redação da tese ocorresse de forma contínua de modo que a sua leitura não fosse interrompida, a relação completa de todos os fragmentos peptídicos identificados está demonstrada no material suplementar, apêndices A - tabelas S1, S2, S3 e S4 constando todas as informações dos dados oriundos da análise proteômica.

Resultados da digestão in gel utilizando diferentes enzimas proteolíticas mostrou uma

elevada cobertura das sequências. A tabela 12 mostra a eficiência de cada enzima utilizada para todas as proteínas identificadas.

Tabela 12. Porcentagem de cobertura da sequência das proteínas identificadas na seda da aranha N. clavipes através da digestão in-gel utilizando diferentes enzimas proteolíticas.

Enzima Espidroína-1 Espidroína-2 Proteína da seda

flageliforme

Quimiotripsina (%) 89.37 72.16 86.76

Tripsina (%) 46.39 25.19 10.80

Pepsina (%) 31.91 25.83 Não identificado

Glu-C/V8 protease (%) 23.96 Não identificado 26.85

Proteinase 10 (%) 16.48 45.82 55.45

Asp-N protease (%) 13.87 Não identificado Não identificado

Proteinase K (%) 12.03 Não identificado Não identificado

Subtilisina (%) 9.61 Não identificado 19.29

Total (%) 98.94 91.02 96.14

Eficiência enzimática foi avaliada pela combinação da cobertura da sequência obtida de todos os spots

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A figura 38 mostra o alinhamento das sequências primárias das proteínas espidroína-1A, espidroína-1B, espidroína-2 e proteína da seda flageliforme identificadas na seda da aranha N. clavipes. Os valores de identidade e similaridade entre essas sequências foram 90 e 94.4%,

respectivamente, entre a espidroína-1A e a espidroína-1B; 48.5 e 60.5%, respectivamente, entre a espidroína-1A e a espidroína-2; 46.4 e 58.7%, respectivamente, entre a espidroína-1B e a espidroína-2; 39.3 e 59.8%, respectivamente, entre a espidroína-1A e a proteína da seda flageliforme; 38.5 e 61.2%, respectivamente, entre a espidroína-1B e a proteína da seda flageliforme; e 45.5 e 68.9%, respectivamente, entre a espidroína-2 e a proteína da seda flageliforme. Podemos observar que os resíduos assinalados em azul escuro são aqueles que se conservam em todas as sequências primárias que foram alinhadas, ou seja, são os resíduos de aminoácidos idênticos em todas as sequências obtidas; em sua grande maioria os trechos de sequência conservados são aqueles ricos em resíduos de glicina. Os resíduos assinalados em azul claro são os resíduos de aminoácidos que apresentam propriedades físico-químicas similares.

128 Figura 38: Alinhamento múltiplo entre as sequências primárias das proteínas espidroína-1A, espidroína-1B, espidroína-2 e proteína da seda flageliforme (Flag. silk protein) identificadas na seda da aranha N. clavipes. As regiões de identidade mais importantes estão assinaladas em azul escuro, enfatizando

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As proteínas espidroína-1 e espidroína-2 são secretadas pela glândula ampulada maior, e constituem as fibras da seda dos raios da teia orbital, do frame e da linha de segurança “escape” (Vollrath, 2000; Römer et al., 2008); e podem ser codificadas por alguns genes diferentes (Beckwitt & Arcidiacono 1994; Römer et al., 2008; Rising et al., 2007; Ayoub et al., 2008). A espidroína-1 está presente em maior quantidade (aprox. 80%) na seda do que espidroína-2, sendo encontrada uniformemente distribuída na fibra. Já a espidroína-2 está ausente nas regiões periféricas formando aglomerados em determinadas áreas centrais da fibra (Sponner et al., 2005; Yazawa et al., 2011). As propriedades mecânicas da seda produzida pela glândula ampulada maior dependem da região central rica em unidades altamente repetitivas de glicina seguida por alanina (Rising et al., 2007). A espidroína-1 possui a repetição de sequências GGX, (GA)n, e (A)n, enquanto a espidroína-2 possui a repetição de sequências (A)n

e GPGXX. As propriedades de força e resistência da fibra são devido à presença das unidades altamente repetitivas de (A)n e/ou (GA)n, que formam estruturas folhas-β cristalinas na fibra,

enquanto as propriedades de elasticidade são devido à presença das unidades altamente repetitivas de GGX e GPGXX (Simmons et al., 1996; Gatesy et al., 2001; Rising et al. 2011). Os segmentos ricos em glicina são postulados para formar diferentes estruturas como as espiral-β e estruturas aleatórias (coil) (Hayashi et al., 1999; Van Beek et al., 2002). A espidroína-1

apresenta uma quantidade baixa de resíduos de prolina, enquanto espidroína-2 apresenta uma grande quantidade desse aminoácido em sua sequência (Savage et al., 2008). Rauscher et al. (2006) identificaram o resíduo de prolina como sendo o determinante primário das propriedades elásticas na espidroína-2, enquanto que a espidroína-1 apresenta maiores propriedades de força e resistência. Sendo assim, a interação dessas proteínas na fibra proporciona uma combinação excepcional de resistência e extensibilidade na seda.

A proteína da seda flageliforme é secretada pela glândula flageliforme, e constitui as fibras da seda da espiral de captura da teia orbital. Essa seda é altamente elástica e em conjunto com as propriedades da seda do frame e do raio da teia orbital, dissipa perfeitamente o impacto da energia das presas. A enorme resistência dessas fibras é importante para a captura e detenção de presas que às vezes são maiores do que as aranhas (Römer et al., 2008; Lefèvre et al., 2011). A proteína da seda flageliforme possui a repetição de sequências GPGGX e GGX, para as quais tem sido proposta a formação de estruturas espiral-β que podem atuar como “nanosprings” moleculares proporcionando elasticidade às fibras (Hu et al., 2006).

Ao contrário das outras proteínas constituintes da seda, a proteína da seda flageliforme não apresenta mudança conformacional durante o processo de fiação (Lefèvre et al., 2011). Estudos indicam a ausência de estruturas cristalinas na fibra (Craig et al., 2002) e sua estrutura

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secundária tem sido descrita como apresentando uma distribuição de conformações, sem uma orientação molecular preferencial. A grande quantidade de resíduos de prolina distribuída regularmente ao longo da repetição de sequência GPGGX, evita a formação de estruturas folhas-β cristalinas na fibra (Ohgo et al., 2006; Rousseau et al., 2009).

As espidroínas identificadas são sintetizadas pelas células epiteliais das glândulas e secretadas no lúmen glandular, onde são armazenadas como uma solução de fiação líquida e cristalina altamente concentrada (Scheibel, 2004) até serem processadas em fibras. Essas proteínas são compostas por um domínio N-terminal não repetitivo, uma região central altamente repetitiva composta por aproximadamente 100 segmentos de sequências ricas em polialanina/glicina, e um domínio C-terminal não repetitivo (Rising et al., 2011). Estudos têm demonstrado que as três partes que compõem a espidroína são estruturalmente e funcionalmente distintas, e até o desenvolvimento do presente estudo ainda não havia sido detectada experimentalmente a proteína completa, i.e., com os domínios N-terminal – região central – e domínio C-terminal numa única molécula. O conhecimento que se tem sobre isso decorre da sequência completa de DNA dos genes das espidroínas, e da detecção isolada de cada um destes domínios na forma proteica. As propriedades mecânicas das fibras da seda têm sido consideradas tradicionalmente como o mais importante parâmetro funcional. No entanto, a produção, secreção, armazenamento, e em particular a conversão controlada das espidroínas do estado solúvel para insolúvel apresenta desafios significativos, sendo provável que os diferentes domínios sejam especializados para atuar em diferentes etapas do processo de fiação (Rising et al., 2011). A região N-terminal é a parte mais conservada das proteínas da seda e, embora a sua função esteja relacionada ao transporte das espidroínas para o lúmen glandular devido à presença de um peptídeo sinal (Moutriuk-Smith et al., 2005), a sua função na estrutura proteica ainda permanece desconhecida. Recentemente, estudos estruturais através

de raios-X de alta resolução realizados com o N-terminal recombinante da espidroína de

E. australis têm sugerido que o domínio N-terminal controla a formação das fibras, inibindo a

agregação precoce das espidroínas durante o armazenamento, e também acelerando e direcionando a formação das fibras durante o processo de fiação conforme o pH vai sendo reduzido ao longo do ducto de fiação (Askarieh et al., 2010). A região C-terminal, constituída por aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos, também se apresenta altamente conservada entre as espidroínas. Devido a sua alta conservação, estudos tem sugerido uma importante atuação na polimerização das fibras (Sponner et al., 2005). Acredita-se que, a medida que o pH e a composição de sais são alteradas ao longo do ducto de fiação, os domínios N e C-terminal possam desencadear a polimerização das fibras (Hagn et al., 2010).

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