Literatürde Schiff bazları ile yapılan önceki çalıĢmalardan;
Gupta ve ark., 2004 yılında schiff bazları 2- (4-fenil-l, 3-tiyazol-2-iliminometil) fenol (L1) ve 1- (4-fenil-l, 3-tiyazol-2-iliminometil) naftalen-2-ol (L2) sentezlemiĢ ve karakterize etmiĢlerdir.
Schiff bazlarının farklı metal iyonlarıyla etkileĢimi, absorpsiyon spektrumları ve fotofloresans
spektrumları UV ile karĢılaĢtırılmıĢtır. Sonuçlar, Schiff bazı Ll ve L2'nin, UV lambası altındaki çıplak gözle doğrudan tespit edilebilecek Al+3
iyonları metanol ile açılma floresan davranıĢını sergilediğini göstermiĢtir. Tespit sınırları L1 ve L2 için 1.0 × 10−6 ve 7.5 × 10−7 olan titrasyon yöntemiyle hesaplanmıĢtır. Her iki sensör de 5.0–13.5 pH aralığında mükemmel floresan davranıĢı sergiletir (Gupta ve ark., 2004).
Lindoy ve ark., 1989 yılında Ni(II) makrohalka kompleksinin izomerik çiftini metal-iyon kontrollü bireĢimle elde etmiĢtir. Kuru aseton ile [Ni(1,2- diaminoetan)3]2+ reaksiyona sokulmuĢ ve oluĢan sarı renkli ürünün baĢlangıçta diimin türevlerinin (91) bir bis-ligant kompleksi (92) olduğu düĢünülmüĢtür. Ancak yapının güçlü kararlılığına dayalı yapılan çalıĢmalarda ürünün birden çok üyeden (93) ve (94) ün izomerik yani formülünün aynı yapılarının farklı bir karıĢımı olduğu saptanmıĢtır (Lindoy, 1989).
ġekil 2. 1. Ni (II) makrohalka kompleksinin türevi ve üyeleri
Schiff baz ligantları kolay sentezlenebilmeleri yanında bir çok metal iyonu ile kompleksler oluĢturmaktadır. Yüksek sıcaklıklarda ( > 100 °C) ve nem varlığında çok sayıda Schiff baz kompleksi çeĢitli reaksiyonlarda yüksek katalizör etkinleĢtirmesine sahiptirler. Schiff baz
25
reaksiyonlarının halka kapanmasında, küçük metallerin varlığı [1+1], büyük metallerin varlığı da [2+2] kompleks yapıları verebilmektedir. OluĢabilecek bu halkalar ġekil 2. 2.‟ de verilmiĢtir. Sonuç olarak istenilen ürünün oluĢumunda metalin varlığı ve bu metalin özelliği oldukça önem arz eder (Nelson, 1980).
ġekil 2. 2. Metal-iyon kontrollü [1+1] ve [2+2] Schiff-baz makrohalka kompleks oluĢumlarının Ģematik gösterimi
Yapılan baĢka bir çalıĢmada Ren ve ark. (2002), 30 adet schiff bazı hidroksisemikarbaziti (Ar- CH= NNHCONHOH) sentezleyip L1210 murine hücrelere göre analiz etmiĢlerdir. Lösemi, kandaki akyuvar hücrelerinin anormal çoğalıp, kontrolsüz Ģekilde belirmesi ile meydana gelen bir kan hastalığıdır. Lenfatik sistemi ve kemik iliğini etkileyen bir kanser çeĢididir. Yapılan analiz sonucunda sentez edilen schiff bazlarının 17 tanesinin lösemi hücrelerine karĢı (L1210) hidroksiüreden çok daha fazla inhibitör etkisinin meydana geldiğini gözlemlediler. Bu gözlemleme yani üç boyutlu yapı aktivite çalıĢmaları Comparative moleculer field analysis – COMFA (mukayeseli moleküler alan analizi) ve Comparative moleculer similarity indices analysis- COMSIA (mukaseyeli moleküler benzerlik indis analizi) metodu kullanılarak
26
hidroksisemikarbazit schiff bazı türevlerinin L1210 hücrelerine karĢı antitümör aktivitelerinin olup olmadığının deney çalıĢmaları yapılmıĢtır (Ren ve ark., 2002).
2010 yılında yapılan bir çalıĢmada; Umu test kalorimetrik bakteriyel bir test sistemidir. Bu testin geliĢtirilmesi DNA‟nın bozunumu ile indüklenen SOS cevabını esas alarak geliĢtirilmesi için çalıĢmalar yapılmıĢtır. Örnek amaçla hazırlanan schiff baz bileĢiklerinin yapılarında fenol, brom, anilin ve metil grubu bulunmaktadır. Bu oluĢan bileĢikler bağlandıkları kümelere binaen etkinlik kazanmıĢlardır. Anilin (NH2) ve metil grupları non elektrofilik özellik göstererek halkanın aktifleĢmesini sağlarlar. Bromda ise güçlü elektrofilik özellik göstererek halkanın etkinliğinin düĢmesinde rol oynar.
Yapılan çalıĢmada elektrofilik ve nonelektrofilik özellik taĢıyan fenolik schiff bazlarının ilaç hammaddesi olarak tercih edilmesi düĢünülmektedir. Bu schiif bazlarının genotoksik etkilerini umu test yani kısa zamanlı bakteriyel test sistemi ile gözlemlemeye çalıĢılmıĢ. Fenolik schiff bazlarının umu test sistemi ile analiz edilmesi sonucu tercih edilen bakteri mekanizmalarına farklı cevaplar verilmemiĢ. Umu bakteri sisteminde S. thyphimurium NM2009 ve S. thyphimurium geni değiĢmiĢ farklı alt türlerin, aralarında genetik farklılıkların bulunduğu bakterilerin kullanımı uygun görülmüĢ. Bulunan bileĢiklerinin hiç biri bakterilerin DNA sı ile etkileĢime girmemiĢ, gen yapılarını değiĢtirmemiĢ, enzim sentezini arttırıp azaltmamıĢtır (Zencir, 2005).
BaĢka yapılan deney çalıĢmalarında metil grubunun mutajen olduğu belirtilmiĢtir. Bir diğer baĢka çalıĢmalarda fenol‟ün tek baĢına mutajenlik oluĢturabileceği tespit edilmiĢtir. Bu yapılan deney çalıĢmasında bileĢiklerimiz mutajen madde olarak çıkmamıĢ. Fakat tercih edilen maddelerin genotoksik olmadığı ortaya konulmamıĢ. BaĢka çalıĢma ve deneyler ile devamı sağlanacaktır (Ceyhan ve ark., 2010).
Literatürde 2007 yılındaki çalıĢmada; sentezlenmiĢ metal kompleksleri, patojenik bakteri türlerine (E. coli, S. aureus ve P. aeruginosa) antibakteriyel etkinlikleri için Schiff baz ligandına kıyasla elenmiĢtir. Schiff baz komplekslerinin aktivitesi, metal iyonlarıyla koordine edildiğinde daha net bir hal almıĢtır. Komplekslerin biyolojik aktiviteleri aĢağıdaki sırayı takip eder: Co (II) = Fe (II)> Ni (II) = Zn (II) = Cu (II)>Cd (II) (Spinu ve ark., 2000).
Deaminasyon, rasemizasyon, transaminasyon, dekarboksilasyona benzer Ģekilde birden çok canlı bilimi tepkimenin meydana gelme düzeneğini anlatabilmek, bu meydana gelen tepkimeler ile ilgili daha detaylı bilgi sahibi olabilmek için amino asitlerin aldehitler ile tepkimesi sonucu oluĢmuĢ Schiff bazlarının incelemeye alınması önemlilik arz etmektedir. Bir çok gerçekleĢmiĢ tepkime sonucunda vitamin B6' nın koenzim olarak bulunduğu tespit
27
edilmiĢtir (YaĢar, 2009). Koenzim olarak bulunan B6 vitamininin yapısı pridoksal (PL) ve pridoksal-5-fosfat' a(PLP) ile içeriği eĢ bileĢikler içerir. Pridoksal-5-fosfat schiff bazı oluĢurken aktif olarak kullanılmaktadır ( Jampilek ve ark., 2005).
ġekil 2. 3. Pridoksal-5‟- fosfat' a benzeri yapıda bulunan salisilaldehit
Yapılan çalıĢmada bazı glisinin salisilaldehit ile meydana getirdiği schiff baz ligandlarının denge reaksiyonları incelemeye alınmıĢtır. Aldehitin fonksiyonel grupların fazla olması oluĢum reaksiyonların açıklığa kavuĢturulmasını zorlaĢtırmaktadır. Bu sebeple schiff bazı birleĢim reaksiyonunun ele alındığı bir çok tepkime de pridoksal-5‟- fosfat' a benzeri yapıda bulunan salisilaldehitten türemiĢ schiff bazları tepkimeye sokulmuĢ ve salisilaldehitin B6 tipi vitamin tepkimesine yardımcı olacağı düĢünülmüĢtür (Sigel ve Naumann, 1976). Bu sebepten ötürü yapılan çalıĢmada bazı glisinin salisilaldehit ile oluĢturmuĢ bulunduğu schiff baz ligandlarının denge tepkimeleri incelemeye alınmıĢtır.
Yapılan çalıĢmadaki amaç; Lösemi olan hastaların tanısının belirlenmesi aĢamasında klinik durumlar, karĢılaĢılan anormal genetik durumlar ve malign hücrenin kökeni önemli derecede rol almaktadır. Tanıda, oluĢan genetik bozukluğun tespiti, hastalığın tahmin ve takibinde önemli derecede bilgiler verdiğinden hastalık için uygun ve hassasiyeti yüksek yöntemler tercih edilmesi gereklidir. Yapılan çalıĢmada Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) ve sitogenetik analiz yöntemleri kullanılmıĢtır. Bu analiz yöntemleri ile lösemi hastalarında belirli genetik bozuklukların tespit edilmesi ve yöntemlerin etkinlik analizlerinin kıyaslamasının yapılabilmesi amaçlanmıĢtır. ÇalıĢmada, 2003-2005 yılları arasında Gülhane Askeri Tıp Akademisi Tıbbi Genetik Bilim Dalı‟na Hemotoloji BD ve Çocuk Hastalıkları Hemotoloji BD‟ndan sevk edilen 64 hastadan alınmıĢ kemik iliği materyallerinden konvansiyonel sitogenetik yani kromozom analizi yapılmıĢtır. Yine bu materyaller FISH yöntemide kullanılarak incelenmiĢtir. Yapılan analiz yöntemlerinden FISH yönteminin sonuç vermesinde baĢarı oranının yüksek olduğu, sitogenetik analizinde sonuç vermede çok yetersiz kaldığı tespit edilmiĢtir. Sitogenetik çalıĢma analizinde yeni oluĢan ve öngörülemeyen
28
bozuklukların bulunması bu analiz yönteminin altın standart method olarak çalıĢılıp analiz edilmesini desteklemektedir. Diğer tercih edilen FISH analiz yöntemi interfaz hücrelerinde çalıĢmaya baĢlaması, sonucun bulunma Ģansını daha çok arttırmaktadır. Ġnterfaz evresi bölünmesi tamamlanmıĢ bir hücrenin yeniden bölünmesi için geçirmiĢ olduğu bir hazırlık evresidir. Sentrozom ve DNA kendini eĢler. Kromatin iplikler halinde çokça görülür. Artık bunca çalıĢmalardan sonra lösemilerin genetiklerinin takip edilmesinde, kritik teĢkil eden problemlerin tanı ve takibinde sitogenetik ve moleküler sitogenetik analiz yöntemlerinin amacına uygun olduğu Ģekilde sıralı olarak tercih edilip kullanılmasının yarar sağlayıp faydalı olacağı düĢüncesine varılmıĢtır (Hoffman ve ark., 2009).
29 3. MATERYALVE METOT
3. 1. Sentez
(E)-N-(anthrasen-9-ylmetilen)piridin-2-amine (P-1) sentezi: Pridin grubu içeren Schiff baz temelli bileĢik P-1‟in sentezi literatürde mevcut olan yöntemlerin modifikasyonu ile gerçekleĢtirildi. Bunun için öncelikle 01 mmol 9-antrasenaldehit ve 0,1 mmol 2-amino pridin ayrı ayrı 20 ml mutlak etanol içerisinde çözüldü. Tüm moleküllerin çözünmesinden sonra amin çözeltisi aldehit çözeltisi içerisine 30 dakika boyunca damla damla ilave edildi ve bir gece oda sıcaklığında karıĢtırılmıĢtır. Ardından oluĢan renkli çökelek süzülerek soğuk etanol, 0,1 N HCI ve son olarak distile su ile yıkanarak P-1 „in sentezi baĢarılı bir Ģekilde gerçekleĢtirildi.
ġekil 3. 1. P-1‟in sentezi Aldehit 9-Antrasenaldehit 1 mol 1000 mmol X 0,1 mmol X=0,0001 mmol‟ dür 0,0001
30 2-aminopridin /mol 1 mol 1000 mmol 0,0001 X mmol
X= 0,0094 mmol‟ dür 10 katı alınır 0,094 2-aminopridin tartıldı. Çözelti hazırlandıktan sonra, hazırlanan çözelti aldehit çözeltisi içerisine 30dk damla damla ilave edildi.
(E)-2-((anthrasen-9-ylmetilen)amino)piridin-3-ol (P-2) sentezi:
Schiff baz temelli bileĢik P-2‟in sentezi yine yukarıda P-1 de anlatıldığı Ģekilde gerçekleĢtirildi. Bunun için öncelikle 0,1 mmol 9-antrasenaldehit ve 0,1 mmol 2-hidroksi-3- amino pridin ayrı ayrı 20 mL mutlak etanol içerisinde çözüldü. Tüm moleküllerin çözünmesinden sonra amin çözeltisi aldehit çözeltisi içerisine 30 dakikada damla damla ilave edildi ve bir gece oda sıcaklığında karıĢtırılmıĢtır. Ardından oluĢan renkli çökelek süzülerek soğuk etanol, 0,1 N HCl ve son olarak distile su ile yıkandı. Reaksiyona girmemiĢ olan baĢlangıç bileĢikleri uzaklaĢtırıldı ve P-2‟in sentezi baĢarılı bir Ģekilde gerçekleĢtirildi.
ġekil 3. 2. P-2‟in sentezi
2-hidroksi 3-amino pridin /mol 1 mol 1000 mmol
0,0001 X mmol
31
X=0,011 mmol‟ dür 10 katı alınır 0,11 2-hidroksi 3-amino pridin tartıldı.
Çözelti hazırlandıktan sonra, hazırlanan çözelti aldehit çözeltisi içerisine 30 dk damla damla ilave edildi.
(E)-N-(anthrasen-9-ylmetilen)kinolin-8-amin (P-3) sentezi:
Schiff bazı temelli bileĢik P-3‟ün sentezi yine yukarıda P-1 de anlatıldığı Ģekilde gerçekleĢtirildi. Bunun için öncelikle 0,1 mmol 9-antrasenaldehit ve 0,1 mmol 8-amino kinolin ayrı ayrı 20 mL mutlak etanol içerisinde çözüldü. Tüm moleküllerin çözünmesinden sonra amin çözeltisi aldehit çözeltisi içerisine 30 dakikada damla damla ilave edildi ve bir gece oda sıcaklığında karıĢtırılmıĢtır. Ardından oluĢan renkli çökelek süzülerek soğuk etanol, 0,1 N HCl ve son olarak distile su ile yıkanarak reaksiyona girmemiĢ olan baĢlangıç bileĢikleri uzaklaĢtırıldı ve P3‟in sentezi baĢarılı bir Ģekilde gerçekleĢtirildi.
ġekil 3. 3. P3‟ün sentezi
8-amino kinolin /mol 1 mol 1000 mmol
0,0001 X mmol
X= 0,014 mmol‟ dür 10 katı alınır 0,14 8-amino kinolin tartıldı. Çözelti hazırlandıktan sonra, hazırlanan çözelti aldehit çözeltisi içerisine 30 dk damla damla ilave edildi.
32
P-1: FT-IR (ATR): 1664 (CH=N). 1H NMR (600 MHz DMSO): δ 8.90-8.79 (m, 3H, Ar-H ve CH=N), 7.97-7.73 (m, 5H, Ar-H), 7.50 (m, 1H, Ar-H), 7.43-7.20 (m, 5H, Ar-H). C20H14N2 için hesaplanan; C, 85.08; H, 5.00; N, 9.92. Bulunan: C, 85.17; H, 4.95; N, 9.89%. %66 verimle sentezlendi.
P-2: FT-IR (ATR): 1666 (CH=N). 1H NMR (600 MHz DMSO): δ 8.89-8.74 (m, 2H, Ar-H ve CH=N), 7.98-7.93 (m, 3H, Ar-H), 7.52-7.48 (m, 1H, Ar-H), 7.41-7.16 (m, 5H, Ar-H), 6.64- 6.61 (m, 2H, Ar-H), 6.31-6.14 (m, 1H, Ar-H). C20H14N2O için hesaplanan; C, 80.52; H, 4.73; N, 9.39. Bulunan: C, 80.52; H, 4.75; N, 9.49%. % 65 verimle sentezlendi.
P-3: FT-IR (ATR): 1675 (CH=N). 1H NMR (600 MHz DMSO): δ 8.74 (bs, 3H, Ar-H, CH=N ve ArCH=N), 8.42 (m, 2H, Ar-H), 7.91-7.74 (m, 4H, Ar-H), 7.40 (m, 6H, Ar-H), 6.67 (m, 1H, Ar-H). C24H16N2 için hesaplanan; C, 86.72; H, 4.85; N, 8.43. Bulunan: C, 86.66; H, 4.79; N, 8.37%. % 55 verimle sentezlendi.
3. 2. Spektroskopik Ölçümler
Ligand metal etkileĢimlerini absorbsiyon ve emisyon çalıĢmaları ile incelemek için, schiff bazı moleküllerinin (2.10-3
M) stok çözeltileri DMF içerisinde hazırlandı. Li+, Na+, Ag+, Ca+2, Ba+2, Co+2, Cs+, Cu+2, Mg+2, Hg+2, Mn+2, Pb+2, Ni+2, Sr+2, Zn+2, Al+3 gibi çeĢitli metal katyonlarının nitrat tuzlarından stok çözeltisi hazırlandı (40.10-3
M, DMF). Ölçüm için ligand metal konsantrasyonu 1:20 oranında hazırlanarak absorbans ve emisyon ölçümleri alındı (shimadzu 1800, hitachi 7200).
3. 3. Antibakteriyel Test
Genellikle laboratuvarlarda antibiyotik duyarlılığının saptanmasında en sık olarak kullanılan yöntem disk difüzyondur. Ucuz ve uygulaması basit olan bu yöntem Kirby- Bauer tarafından geliĢtirilmiĢtir. Bu test, kağıt disklere emdirilen antibiyotiğin, duyarlılığı araĢtırılan organizmanın inoküle edildiği besiyerine difüzyonu ile gerçekleĢtirilmektedir. Belli miktarlarda antibiyotik emdirilmiĢ kagıt diskler, test edilecek olan mikroorganizmanın yoğun bir Ģekilde inoküle edildiği katı besiyerlerine yerleĢtirilir. Diskler bir süre sonra çözünüp agara dogru difüze olurken, diğer yandan inoküle edilen mikroorganizma da çoğalmaya baĢlar. Ġnkübasyon süresinden sonra antibiyotiğin inhibitör konsantrasyonlarının sağlandığı diskin çevresinde üreme görülmez ve zonlar oluĢmaya baĢlar. Antibiyotiğe karĢı duyarlılık, diskin etrafında oluĢan inhibisyon zonu ile doğru orantılıdır. Yani mikroorganizma antibiyotiğe ne
33
kadar duyarlı ise oluĢan zon çapıda o kadar geniĢ olacaktır. Inhibisyon zonunun çapı mm seklinde ölçülerek, standart zon tablolarına göre değerlendirmeler yapılır ve duyarlılık durumu belirlenir. Bu yöntemde, incelenecek olan mikroorganizmalar (B. subtilis ve E. Coli) Mueller Hinton Agar (MHA) 4-5 saat süreyle 37°C'de inkübe edilir. Bulanıklık oluĢtuktan sonra McFarland 0.5 (108 mikroorganizma / ml)'e göre ayarlanarak mikroorganizmalar inöküle edilir (Berber ve ark., 2013). Takiben farklı moleküller (P-1, P-2 ve P-3) içeren diskler steril bir pens yardımıyla agar yüzeyine yerleĢtirilir. Daha sonra besiyerleri 18-24 saat süreyle 35°C'de inkübe edilir ve oluĢan inhibisyon zonları ölçülür.
34 4. BULGULAR
4. 1. Sentez ve Karakterizasyon
Bu çalıĢma kapsamında Schiff bazı temelli floresans özelliğe sahip pridin ve kinolin yapılı üç yeni tip molekül baĢarı ile sentezlendi ve bu bileĢiklerin seçilen bazı metal katyonlarına karĢı iyon bağlama özellikleri FT-IR (ATR), Florimetri, UV-vis ve 1
H-NMR gibi spektroskopik ve/veya spektrofotometrik yöntemler kullanılarak araĢtırıldı. Schiff bazlarının sentezinde aldehit türevi olarak 9-antrasenaldehit bileĢiği kullanılırken, amin bileĢikleri sırası ile P-1 için 2-Amino-pridin, P-2 için 2-Amino-3-hidroksi-pridin ve son olarak P-3 için ise 8-Amino- kinolin bileĢikleri kullanıldı. AĢağıdaki Ģekillerde P-1, P-2 ve P-3 bileĢiğine ait sentez Ģeması veilmiĢtir.
35 ġekil 4. 1. Schiff baz bileĢiklerinin sentez Ģeması
Sentezi gerçekleĢtirilen pridin ve kinolin yapılı Schiff baz bileĢiklerinin yapısal karakterizasyonu 1H-NMR ve FT-IR (ATR) ile aydınlatıldı. P-1, P-2 ve P-3 bileĢiklerinin 1H- NMR analizlerinden baĢlangıç reaktifleri olan 9-antrasenaldehit ve amin yapılı pridin veya kinoline ait karakteristik amin ve aldehit pikleri reaksiyon sonunda sırası ile 4.20-4.45 ve
36
9.75-10.05 ppm civarında görülmezken amin ve aldehit gruplarının kondenzasyonundan elde edilen ve 8.90-8.95 ppm civarında Schiff baz yapısı olan imin (C=N) gruplarına ait piklerin varlığı ligandların sentezinin baĢarılı bir Ģekilde gerçekleĢtiğini ispatlamıĢtır. Bazı bileĢiklerde bu imin pikleri diğer aromatik piklerle çakıĢmıĢ olup net olarak yeri belirlenememiĢtir. Ancak yapılan integrasyonda bu yapılara ait birer hidrojen pikleri tespit edilmiĢtir. Yine FT-IR (ATR) analizlerinden baĢlangıç reaktiflerine ait olan ve 3300 cm-1 civarında kuvvetli bir gerilme bandı olan primer aminlere (R-NH2) ait pikler IR analizlerinde kondenzasyon reaksiyonu sonunda görülmemiĢ olup sentez reaksiyonlarının baĢarı ile gerçekleĢtiğini ispatlamıĢtır. Ayrıca aldehit türevi olan 9-antrasenaldehit‟e ait olan ve genellikle 1715 cm-1 civarında ortaya çıkan aldehit (CH=O) gerilmelerine ait olan pikin reaksiyon sonunda ortadan kaybolması da Schiff baz sentezlerinin baĢarıyla gerçekleĢtiğini göstermiĢtir. Yapı aydınlatma çalıĢmalarından baĢlangıç maddelerine ait olan karakteristik amin veya aldehit piklerinin reaksiyon sonunda kaybolması ve bu amin (R-NH2) ile aldehitin (CH=O) birleĢmesi ile olan imin (CH=N) yapılarına ait yeni piklerin analizlerde görülmesi Schiff baz sentez reaksiyonlarının baĢarı ile gerçekleĢtirildiği göstermiĢtir.
37 ġekil 4. 3. P-2‟nin FT-IR (ATR) grafiği
38 ġekil 4. 5. P-1‟in 1