Çalışma öncesi çalışma protokolü ARRIVE 2.0 kılavuzlarına uygun şekilde Experimental Design Asistant (EDA) ile planlanarak çalışma protokolü oluşturulmuştur (Şekil-5) (199, 200).
Şekil-6: Deneysel çalışma dizaynının şeması.
50 sıçan
Alkali yanık oluşturulması
50 göz
10 göz
Randomi -zasyon
TZP
Sham Hidrojel Sitrat TZP +
Hidrojel Kontrol
ParametreleriOKT
Ortalama Tümleşik yoğunluk Sirkülarite
Alan Solidite
Klinik Parametreler
Epitel Neovaskül
arizasyon Limbal hiperemi
Korneal opasite
ELİSA
İL-1𝛽
MMP-9
Histolojik Bulgular
Epitel Stromal
hücre İnflamasyo
n Neovaskül
arizasyon
Ön Segment Fotoğraf Bulguları
Epitel defekti yüzdesi
İstatistiksel Analiz -Değerlendirme
Trombositten Zengin Plazmanın Elde Edilmesi
TZP elde etmek üzere sistemik hastalık belirtisi olmayan sağlıklı sıçanlar kullanıldı. Anestezi tekniği olarak 50 mg/kg ketamin (Ketalar®, Pfizer lt. Kent, Birleşik Krallık) ve 10 mg/kg ksilazin (Rompun®, Bayer, Almanya) kombinasyonu intraperitoniyel olarak kullanılarak 15 dakika beklendi. Sonrasında yarı açık maske yöntemi ile Sevofluran %100 (Sevoran® %100, Abbvie, Queenborough Kent, İngiltere) ventilasyonu eklendi. Anestezi derinliği çimdikleme refleks kaybı ile değerlendirildi.
TZP elde edilmesi için Gandolfi ve ark. tarafından belirtildiği şekilde hazırlandı (13). İntrakardiak %10’luk potasyum klorid enjeksiyonu sonrası intrakardiak punktur yolu ile kan elde edildi. Alınan yaklaşık 4,5 ml kan, sitratlı TZP tüplerine (PRP Kit, TLAB, Bursa, Türkiye) konarak oda havasında güneşten korunarak santrifüj ünitesine getirildi. TZP tüpünden alınan kapiller kan otomatize kan hücresi sayacı (Nihon Kohden Celltac 𝛼, Tokyo, Japonya) ile sayılarak DEPA klasifikasyonunda kullanılmak üzere kaydedildi (201). Sonrasında santrifüj (TLAB Centrifuge S-106, TLAB, Bursa, Türkiye) cihazına alınarak önce 220 G’de 10 dakika süre ile santrifüj edildikten sonra süpernatan ayrıldı ve kalan plazma örneklemek üzere otomatize kan hücre sayacında analiz edildi. Çıkan sonuçlar DEPA kalsifikasyonuna göre kalitesi belirlendi (201). Oluşan PRP 5 ml’lik tüplerde, güneş ışığı almayacak şekilde +4º’de tedavi için muhafaza edildi. Bu işlem günaşırı 4 hayvan üzerinde uygulandı ve TZP’ler hazırlandıktan iki gün içerisinde kullanıldı (Şekil-7).
Şekil-7: TZP tüpünde hazırlanmış altta süpernatan ve üstte trombositten zengin plazma.
Elde edilen TZP’ler DEPA sınıflamasına göre saflık, zenginleştirme oranı ve platelet kurtarma yüzdeleri hesaplandı (Şekil-8).
Şekil-8: Hazırlanan 4 adet TZP’nin DEPA sınıflamasına göre değerleri.
Muayenelerin Yapılması
Denekler yanıktan önce cerrahi mikroskop altında muayene edildi. Yanık oluşturulduktan sonra 24. saat, 48. saat, 72. saat, 96.saat ve 6. Ve 8. günlerde muayene yapıldı.
Fotoğraflama sonrasında denekler, cerrahi mikroskop altında 16X büyütmede incelendi. Kornea opasitesi, siliyer hiperemi, korneal epitel boyanması, neovaskülarizasyon alanı ve neovasküler damar boyutu incelendi.
Semi kantitatif olarak Tablo-6 ve Tablo-7 ‘deki şekilde skorlandı (202-204).
Tablo-6: Korneal opasite, siliyer hiperemi, korneal epitelyal boyanma parametrelerinin skorlanması.
Parametreler Skor Klinik Muayene
Korneal Opasite
0 Şeffaf Kornea
1 Minimal Yüzeysel Opasite
2 İris damarları ve pupil kenarı seçilebilecek şekilde hafif derin (stromal) opasite
3 Sadece pupil kenarı seçilebilecek şekilde orta derecede stromal opasite
4 Sadece ön kamara seçilebilecek şekilde yoğun stromal opasite
5 Ön kamara seçilemeyecek şekilde total opak kornea
Siliyer Hiperemi
0 Yok
1 Var ancak 1 mm’den az 2 Var ve 1 ile 2 mm arasında 3 Var ve 2 mm’den fazla
Korneal Epitelyal Boyanma
0 Boyanma yok
0,5 Hafif Punktat Boyanma 1 Diffüz Punktat Boyanma
2 Korneanın 1/3’ünden azını kapsayacak şekilde diffüz boyanma
3 Korneanın 1/3’üden fazlasını kapsayacak şekilde diffüz boyanma
4 Korneanın 2/3’üden fazlasını kapsayacak şekilde diffüz boyanma
Tablo-7: Neovaskülarizasyon alanı ve neovasküler damar büyüklüğü parametrelerinin skorlanması.
Parametreler Skor Klinik Muayene
Neovaskülarizasyon Alanı
0 Neovaskülarizasyon yok
1 Neovasküler damarlar limbusta
2 Neovasküler damarlar limbusu geçerek kornea santraline doğru ilerliyor
3 Neovasküler damarlar kornea santraline ulaşmış
Neovasküler Damar Büyüklüğü
0 Neovaskülarizasyon yok
1 Neovasküler damarlar cerrahi mikroskop altında dikkatli bakılınca seçilebilir
2 Neovasküler damarlar cerrahi mikroskop altında kolaylıkla seçilebilir
3 Neovasküler damarlar mikroskopsuz dahi seçilebilir.
Örneklerin Toplanması
Anestezi ve analjezi uygulamasında of 50 mg/kg ketamin (Ketalar®) ve 10 mg/kg ksilazin (Rompun®) kombinasyonu intraperitoniyel olarak kullanıldı.
Mikroskopik inceleme için sıçanlara konjonktiva forcepsi ve makası yardımı ile cerrahi mikroskop altında (Carl Zeiss OPMI 1-DFC, Almanya) enükleasyon yapıldı. Enükleasyon yapılan göze mikroskop altında limbusun hemen komşuluğundan 23 gauge keratom yardımı ile yan giriş açıldı ve kornea makası ile 360 derece keratektomi yapıldı. Keratektomi materyalinde limbus dokusu alınmamasına özen gösterildi. Yuvarlak olarak çıkarılan kornea dokusu, 15’lik bistüri yardımı ile çap hizasından ikiye bölündü. İkiye ayrılan doku randomize
şekilde bir tanesi Eppendorf tüpüne bir tanesi de doku takip kasedine konarak
%10’luk tamponlu formaline yerleştirildi.
Sitrat Elde edilmesi
PRP tüpünün içerisinde yer alan 0.9 ml %3,2’lik sodyum sitrat (Sodyum sitrat çözeltisi, ADR group, İstanbul, Türkiye) üzerine 4,5 ml PBS ile dilüe edilerek topikal tedavi için sitratlı çözelti hazırlandı. Bu çözelti +4º’de muhafaza edildi.
Hidrojel Uygulanması
Çapraz bağlanmış sıvı formda polietilen glikol, sodyum aljinat ve polivinil pirolidon içeren hidrojel (Agnigel, TLAB, Bursa, Türkiye), steril şartlar altında 20 cc’lik enjektöre dolduruldu (Şekil-9A). Her gün yeni bir enjektör açıldı ve açılan enjektör bir gün kullanıldı. Günde üç kez kornea üzerine Şekil-9B’de görüldüğü gibi oküler yüzeyi kaplayacak kadar uygulandı. Fazla hidrojel, steril sponj ile temizlendi.
Şekil-9: A: 20 cc enjektör içerisinde bulunan sodyum aljinat-polietilen glikol- polivinil-pirolidon kombinasyonu içeren yarı sentetik hidrojel, B: Hidrojelin oküler yüzeye uygulanmış görüntüsü.
Ön Segment Fotoğraflaması
Vizitler sırasında yanık sonrası 1. gün, 3. gün, 6. gün ve 8. günlerde ön segment fotoğrafları çekildi. Topikal olarak 1/10 olarak FTS ile dilüe edilmiş flöresin (Fluosine 500 mg/5 ml, Pharmargus, İstanbul, Türkiye) damlatılarak kornea, makro lens (Nikon AF-S 105 mm f/2.8G IF-ED VR Mikro lens, Tokyo, Japonya) yardımı ile dijital kamera (D500 DSLR, Nikon, Tokyo, Japonya) ile fotoğraflandı. Fotoğraflar aynı mesafeden, aynı aydınlatma ve aynı diyafram ayarları ile çekildi (1/200 sn., f/4, 105 mm, ISO 800, 1:1 büyütme).
Son vizitte, ön segment fotoğraflaması biyomikroskop aracılığı ile yapıldı.
Bunu mümkün kılmak adına bir adet rat strainer, pleksiglas bir plakaya yapıştırıldı (Şekil-10A) ve biyomikroskopik çerçeve oturması adına ön tarafına iki adet yuvarlak açıldı. Biyomikroskopa (Topcon SL-D7, Tokyo, Japonya) monte kamera sistemi (Topcon DC-1, Tokyo, Japonya) vasıtasıyla deneklerin her iki korneası biyomikroskobun kendi ataçmanı olan ışık difüzörü ile aynı yakınlaştırmada ve
A B
çözünürlükte, tam karşı açıdan olacak şekilde fotoğraflandı ve değerlendirilmeye alındı.
Ön Segment Fotoğraf Analizi
Çekilen fotoğraflar üstünde epitel defekti Photoshop CC (Trial Version, Adobe Inc, San Jose, ABD) programı kullanılarak epitel defektinin piksel cinsinden alanının total korneanın piksel cinsinden oranı kaydedildi ve istatiksel değerlendirilmeye alındı (Şekil-9).
Şekil-10: Total korneal alanın piksel cinsinden hesaplanması (üstte), epitel defektinin piksel cinsinden hesaplanması (altta). (*) ile gösterilen sütun piksel cinsinden alanı göstermektedir.
*
*
Ön Segment Optik Koherens Tomografi (OKT) Çekilmesi
Ön segment fotoğraflaması sırasında kullanılan aynı sistem, ön segment OCT çekimi sırasında da kullanıldı (Şekil-10B). Spektral domain OCT cihazına (Heidelberg Engineering Spectralis OCT, Heidelberg, Almanya) adapte olan ön segment OCT modülünü (Heidelberg Engineering Anterior Segment Module, Heidelberg, Almanya) kullanarak ön segment OCT çekildi. Ölçümler kornea santral alandan raster tarama tarzında yapıldı. OCT çekim ayarları şu şekilde idi;
Resolution mode: High Speed, Scan Focus: 33 D, Scan Angle 30º, ART mode ON, EDI mode OFF şeklinde idi. Analiz için yerleşik OCT programı (Heidelberg Eye Explorer, Heidelberg, Almanya) kullanıldı.
Şekil-11: A: Ön segment fotoğraflaması sırasında görünüm, B: Ön segment OKT çekimi sırasındaki görünüm.
OKT Analizi
ART modunda en az 5 imaj ortalaması alınan, kalitesi 25 dB üzerindeki çekimler çalışmaya dahil edildi. Çekilen tüm OKT ölçümlerinin infrared görüntüdeki pupil santrali işaretlendi. Pupil aksının santralinden geçen OKT ölçümleri esas alındı. Santraldeki noktanın anterior ve posteriorundaki 1.500 µ’luk noktaları işaretlendi. Yüksek çözünürlüklü çıktısı yerleşik OKT programından alındı.
OKT görüntüleri ImageJ2 (Version 2.3.0, Rasband, W.S., US National Institutes of Health, Bethesda, MD)’a alınarak işlendi. Her imaja ayrı ayrı aşağıdaki işlemler uygulandı; yerleşik programdan işaretlenen santral 3.000 µ’u içerisine alacak şekilde dikdörtgen şeklinde kırpma işlemi yapıldı. Görüntü 8 bite çevrildi. Sonrasında Western blot analizi gibi özellikle arkaplan uniform olduğunda kullanılan görüntü analizlerindeki gibi, arkaplan çıkarılması için kullanılan metotlardan biri olan şu metot kullanıldı; arkaplan gürültüsünün ortalama gri değeri hesaplandı ve ortalama değer, komutu kullanılarak tüm resimden çıkarıldı (205). Bu işleme arkaplan görüntüsünün ortalama gri değeri 2’nin altına inene kadar devam edildi.
Ölçeklendirmek için görüntüde piksel cinsinden ölçülen boydan boya uzunluk 3.000 µm’ye kalibre edildi. Sonrasında yazılımdaki makine öğrenimi (Machine Learning) yoluyla segmentasyon aracı olan Trainable Weka Segmentation sekmesi kullanılarak segmentasyon işlemi uygulandı.
Segmentasyon ayarları Şekil-13A’da gösterilen şekildeydi. Segmentasyon tamamlandı ve görüntü binarizasyonu gerçekleştirildi. Binary (ikili sistem) görüntü üzerinden korneaya denk gelen alan wand tool ile seçilerek Region of Interest (ROI) Manager’a eklendi. Orijinal imaj üzerine ROI managerden çekilen ROI’de Şekil-13B’deki parametreler analiz edildi. Çıkan sonuçlar istatiksel analiz için kaydedildi.
Şekil-12: OKT’de yapılan segmentasyon analizi. A: OKT programından görüntü ImageJ2 programına aktarıldı. Santralde işaretlenen 3.000 µm’lik alan kırpıldı. B: Trainable Weka Segmentasyonu sekmesiyle korneal alan işaretlenerek programa tanıtıldı ve binary (ikili kod) çıktı elde edildi. C: Elde edilen binary çıktıdan region of interest (ROI) seçildi ve asıl imaj üzerine uygulandı. µm: Mikrometre, Tif: Tag Image File, RGB: Red-Green-Blue, K:
Kilobayt.
Analiz Yapılan Parametreler
Alan (Area) ölçümü, seçilen ROI’nin piksel kare cinsinden alanını verir.
Eğer kalibrasyon yapılmışsa, piksel karenin kalibre edilen yeni uzunluktaki değeri verilecektir. Bu çalışmada birimi µ2’dir.
Ortalama (Mean), piksellerin 8 bitlik imajdaki griliklerinin 0’dan 255’e kadar olan gri skaladaki değerinin seçilen ROI’de matematiksel olarak ortalamasını verir. En düşük değer olan 0 siyahken, 255 tamamen beyazdır. Birimi piksel değeridir.
Tümleşik yoğunluk (TY), seçilen ROI alanındaki piksellerin toplam değeridir. Birimi piksel değeridir. Şu şekilde formüle edilebilir:
“TY = (piksel sayısı) x (ortalama gri değeri – arkaplan) “
Ham tümleşik yoğunluk (HTY), seçilen ROI’deki piksel değerlerinin toplam değeridir. Birimi piksel değeridir. Yani HTY, TY’nin kalibrasyonsuz halidir.
Sirkülarite seçilen ROI’nin, mükemmel bir daireye ne kadar benzediğidir.
Sonucu ne kadar 1,0 ‘a yakınsa, ROI o kadar daireseldir. Birimi yoktur. Şu şekilde formüle edilebilir: Sirkularite = 4p x (alan) / (çevre) 2.
Solidite, alanı, konveks alana bölerek elde edilir. Birimi yoktur (206).
Şekil-13: 0’dan 255’e kadar olan gri skala.
Şekil-14: A: Trainable Weka Segmentation sekmesinin seçili ayarları, B: Çıktısı alınan ayarlar gösterilmiştir.
Histolojik İnceleme ve Analiz
Materyal-Metot
Histopatolojik çalışmalar Bursa Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı Histopatoloji Laboratuvarı’nda yapıldı. Kornea dokusu örnekleri, %10’luk nötral formalin solüsyonunda oda sıcaklığında 48 saat boyunca tespit edildikten sonra, örnekler rutin histolojik prosedüre tabi tutuldu.
Dokular, doku takip cihazında bir gece boyunca, %10’luk formalin ardından birer saat %70, %80, %90’lık etanol serileri şeklinde takibe alındı. Sonrasında tüm gece absolü alkolde bekletildi. Ksilenden 2’şer kez 1,5 saat, parafinden ise bir
kez 1,5 saat, takiben iki kez 1 saat takibe alındı. Dokuların içerdiği su, etanol serileri ile uzaklaştırıldı. Son olarak sıvı parafin içinde bekletilerek doku boşluklarının parafinle dolması sağlandı. Takip sonrası dokular etiketlenerek, parafin bloklara korneanın kesitsel histolojisini gösterecek şekilde gömüldü.
Parafin bloklardaki örneklerden, mikrotomla (Leica RM 2125) randomize şekilde 4 μm’luk kesitler elde edildi. Bu kesitler, standart hematoksilen-eosin (H-E) ile boyama boyandıktan sonra entellan ile kapatıldı.
Olympus CX41 mikroskoba monte edilmiş bir Olympus DP20 dijital kamera ile görüntüler alındı.
Mikroskobik incelemede 5 adet 40x büyütmede:
• Epitel kalınlığı,
• Epitelde nekroz,
• Epitelde dejenerasyon incelendi ve aşağıda belirtildiği gibi skorlandı.
10 x büyütmede ise:
• İnflamatuar hücre yoğunluğu
• Stromal hücre yoğunluğu incelendi ve aşağıda belirtildiği gibi skorlandı. Epitel kalınlığı mikrometre cinsinden ölçülerek değer verildi.
Epitel nekrozu ve epitel dejenerasyonu iki araştırıcı tarafından skorlanarak ortalamaları değerlendirildi. Bu araştırıcılar grupları bilmeden kör yöntem ile değerlendirme yaptılar. Skorlama aşağıdaki şekilde semi kantitatif yöntemle skorlandı;
Tablo-8: Histopatolojik değerlendirme ve skorlamalar tabloda gösterilmiştir.
Epitel Dejenerasyonu ve Nekroz Skoru
Histopatolojik Değerlendirme (Tüm Epitelde)
0 Dejenerasyon ve nekroz yok
1-Hafif 0-5 Arası dejeneratif ve/veya nekrotik hücre 2-Orta 5-20 Arası dejeneratif ve/veya nekrotik hücre 3-Şiddetli 10 ve üstü sayıda dejeneratif ve/veya nekrotik
hücre Stromal Hücre
Yoğunluğu
Histopatolojik Değerlendirme (x10)
0-Normal Normal
1-Hafif Rastgele 5 alanda, toplam 10 veya daha az stromal hücre
2-Orta Rastgele 5 alanda toplam 10-50 arası stromal hücre
3-Şiddetli Rastgele 5 alanda toplam 50 veya daha fazla stromal hücre
İnflamatuar Hücre Yoğunluğu
Histopatolojik Değerlendirme (x10)
0-Normal Normal
1-Hafif Rastgele 5 alanda toplam 10 veya daha az yangı hücresi
2-Orta Rastgele 5 alanda toplam 10-50 arası yangı hücresi
3-Şiddetli Rastgele 5 alanda toplam 50 veya daha fazla yangı hücresi infiltrasyonları
Stromal hücre yoğunluğu 10x büyütmede 5 farklı alan sayılarak burada gözlenen stromal hücrelerin varlığı incelendi ve tablodaki şekilde semi kantitatif
yöntemle skorlandı. İnflamatuar hücre yoğunluğu tablodaki şekilde semi kantitatif yöntemle skorlandı. Yeni damar oluşumları (neovaskülarizasyon) ise 10x büyütmede tek bir alanda içi eritrosit ile dolu olan tüm damarlar sayılarak hesaplandı.
Biyokimyasal Analizler
Enükleasyon yapılan gözden alınan ve yaklaşık 10-20 µg kornea materyali steril Eppendorf tüpüne konduktan sonra vakit kaybetmeden -80º ‘de dondurularak korundu. Enzim bağımlı immunosorbent assay (ELISA) ölçümleri için dondurulmuş dokular Eppendorf tüpünden çıkarıldıktan oda ısısına gelmesine izin verilmeden sonra sıvı azot ile dondurularak buzlu havana alındı.
Havanda ezilip sonra üzerine 100 µl steril FTS eklenerek homojenizat oluşturuldu ve Eppendorf tüpüne geri konuldu. Sonrasında 5000 g’de 5 dakika süre ile +4º’de santrifüje edilerek süpernatan elde edildikten sonra ölçüme kadar -20º’de muhafaza edildi.
Kornea Dokusunda Enzim Bağımlı İmmunoabsorban Assay (ELISA) Yöntemi ile Yapılan İL-1𝛽 Ölçümü
Çalışmamızda Rat ELISA IL-1𝛽 Kiti (BT Laboratories, Pekin, Çin) kullanıldı. Deney gününe kadar kitler 2-8 derecede saklandı. Tüm reaktifler, standart solüsyonlar ve örnekler, kit kılavuzunda belirtilen talimatlara göre hazırlandı. Standart solüsyonlar kılavuza göre seyreltildi. Standartların (St) dilüsyonu aşağıda belirtildiği gibi yapılmıştır
• St Numara 5 (40 ng/L): 120 μL orijinal St + 120 μL St dilüent
• St Numara 4 (20 ng/L): 120 μL orijinal St 5 + 120 μL St dilüent
• St Numara 3 (10ng/L): 120 μL orijinal St 4 + 120 μL St dilüent
• St Numara 2 (5ng/L): 120 μL orijinal St 3 + 120 μL St dilüent
• St Numara 1 (2,5ng/L): 120 μL orijinal, St 2 + 120, μL St dilüent
Kullanmadan önce tüm reaktifler oda sıcaklığına getirildi. Ölçüm oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Test için gerekli şerit sayısı belirlendi. Kuyucuklara 50 μl standart eklendi. Standart çözelti antikor içerdiğinden standart kuyucuklara antikor eklenmedi. Numune kuyucuklarına 40 μl numune eklendi ve sonra 10 μl anti-İL-1𝛽 antikoru ilave edildi. Ardından numune kuyularına ve standart kuyulara 50 μl streptavidin- Horseradish Peroksidaz (HRP) eklendi (boş kontrol kuyuları hariç) ve karıştırıldı. Plaka, bir mühürleyici ile örtüldü ve 37°C'de 60 dakika inkübe edildi. Mühürleyici çıkarıldı ve plaka, 5 kez, 25 kat seyreltilmiş yıkama tamponuyla yıkandı. Kuyucuklar her yıkama için 5 dakika en az 0,35 ml yıkama tamponu ile yıkandı. Plaka, bir emici malzeme üzerine kurulandı. Her kuyucuğa 50 μl substrat solüsyonu A eklendi. Sonrasında her kuyucuğa 50 μl substrat solüsyonu B eklendi. Plaka, yeni bir mühürleyici ile kapalı olarak 37°C'de karanlıkta yaklaşık 20 dakika inkübe edildi. Her kuyucuğa 50 μl durdurma solüsyonu eklendikten sonra mavi rengin sarı renge dönüştüğü görüldü. Durdurma solüsyonunu ekledikten sonra 10 dakika içerisinde 450 nm'ye ayarlanmış bir optik okuyucu (Multiskan FC Microplate Photometer, Thermo-Scientific, MA, ABD) kullanarak her kuyucuğun optik dansite (OD) değeri ölçüldü. Standartların konsantrasyonu ve karşılık gelen OD değerlerine göre, standart eğri doğrusal regresyon denklemi hesaplandı ve ardından regresyon denklemindeki numunenin OD değerleri hesaplandı.
Kornea Dokusunda Enzim Bağımlı Immunoabsorban Assay (ELISA) Yöntemi ile Yapılan MMP-9 Ölçümü
Çalışmamızda çift antikor-sandviç ELISA yöntemi kullanan Katalog No:201-11-0322 ‘lu Rat MMP-9/Gelatinase B ELISA Kit (Shanghai Sunred Biological Technology Co., Ltd., Çin) kullanıldı. Standart solüsyonlar kitte belirtilen prosedüre göre seyreltildi. Standartların (St) dilüsyonu aşağıda belirtildiği gibi yapılmıştır;
• St Numara 5 (160 ng/L): 120 μL orijinal St 6 + 120 μL St dilüent
• St Numara 4 (80 ng/L): 120 μL orijinal St 5 + 120 μL St dilüent
• St Numara 3 (40ng/L): 120 μL orijinal St 4 + 120 μL St dilüent
• St Numara 2 (20ng/L): 120 μL, orijinal St 3 + 120 μL St dilüent
• St Numara 1 (10ng/L): 120 μL, orijinal St 2 + 120 μL St dilüent
Standart kuyulara öncelikle standart 50 μl, Streptavidin-HRP 50 μl koyuldu. Standart solüsyon kendi içerisinde kombine antikora sahipti, dolayısıyla antikor eklenmedi. Test kuyucuklarına 40 μl numune eklendi ve ardından her iki üre antikoru eklendi (10 μl MMP-9/Gelatinase B antikoru ve Streptavidin-HRP 50 μl). Sonrasında sızdırmazlık plakası kapatıldı ve hafifçe sallayarak 37°C'de 60 dakika inkübe edildi. FTS ile 30 kat seyreltilmiş yıkama konsantresi her seferinde 0.35 ml yıkama solüsyonu ile yıkandı. Sıvı boşaltıldı ve kalan FTS sallayarak uzaklaştırıldı. Her birine 50 μl kromojen solüsyonu, ardından kromojen solüsyonu B 50 μl eklendi ve yavaşça karıştırıldı. Işıktan uzakta, 37°C'de 10 dakika inkübe edildi. Reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 50 μl durdurma solüsyonu eklendi ve mavi rengin hemen sarıya dönüştüğü görüldü. Asıl ölçüm için, 15 dakika sonra OD’si 450 nm dalga boyunun altında, optik okuyucuda (Multiskan FC Microplate Photometer, Thermo-Scientific, MA, ABD) ölçülerek gerçekleştirildi. Standartların konsantrasyonu ve karşılık gelen OD değerlerine göre, standart eğri doğrusal regresyon denklemi hesaplandı. Ardından bu regresyon denklemindeki numunenin OD değerleri hesaplandı.
Şekil-15: A: Sıvı azotta dondurulan kornea dokusunun havandaki görüntüsü, B:
İL-1𝛽 Enzim bağımlı immunoabsorban assay (ELISA) ölçümü öncesi kuyucuklardaki görüntüsü, C: Kuyucuklara durdurma solüsyonu damlatıldıktan sonra aldığı sarı rengin görüntüsü.
İstatistiksel Analiz
Çalışmada elde edilen veriler Microsoft Excel® (Microsoft Excel for Mac®, Versiyon 16.58, Redmond, Washington, ABD) ile işlendi ve istatistiksel analizi için IBM® SPSS® Statistics (SPSS Inc., Chicago, Illinois, ABD) programının 26.0 versiyonu kullanıldı. Değişkenlerin normal dağılıma uyup uymadığı Kolmogorov–
Smirnov/Shapiro Wilk testleri ile değerlendirildi. Tanımlayıcı analizlerde, normal dağılıma uyan değişkenler ortalama (± standart sapma), normal dağılıma uymayan değişkenler ise, medyan + (minimum-maksimum) değerleri verildi.
Normal dağılıma uyan değişkenler One-Way ANOVA testi ile değerlendirildi, varyansların homojenitesi de test edildi. Normal dağılıma uymayan değişkenlerde Kruskal-Wallis testi ile gruplar arasında fark olup olmadığı belirlendi. Daha sonra Mann-Whitney U testi kullanılarak ikili gruplar karşılaştırıldı
ve ikili kıyaslamalar yapıldı. Varyanslar eşit ise Posthoc testlerinden Bonferroni, eşit değilse Tamhane kullanıldı. Bağımlı ve parametrik olmayan değişkenler için Friedman testi uygulandı. Korelasyon analizi için normal dağılıma uyan değişkenlerde Pearson korelasyonu, normal dağılıma uymayan değişkenlerde Spearmen korelasyon analizi kullanılmıştır. İstatistiksel anlamlılık için p ≤ 0,05 kabul edildi, ayrıca p ≤ 0,01 ve p ≤0,001 olduğu durumlar da özellikle belirtildi.
Çalışmada grafikler Prism 9 (GraphPad Software Inc., San Diego, ABD) yardımı ile çizildi.
BULGULAR
Histolojik Bulgular
Histolojik olarak incelenen tüm kornealarda epitel, stroma ve endotel tabakası görüldü.
Şekil-16: Kontrol grubundan normal bir korneanın görünümü, x4, H-E.
Şekil-17: Sham grubundan bir
korneada stromal hücre yoğunluğu 3+, x4, H-E.
Şekil-18: Sham grubundan bir korneada stromal hücre yoğunluğu (yıldız) 3+, x10, H-E.
Şekil-19: Sham grubundan bir
korneada stromal hücrelerin artışı 3+, bağ doku hücreleri (kırmızı ok), nötrofil hücreleri (sarı ok) x40, H-E.
Şekil-20: Kombine hidrojel ve TZP grubundan bir korneada stromal hücrelerin artışı 3+, x10, H-E.
Şekil-21: Sham grubundan bir korneada artmış yangı hücresi infiltrasyonları (yıldız), x20, H-E.
Şekil-22: Sham grubundan bir korneada artmış nötrofil hücresi infiltrasyonları (yıldız), x40, H-E.
Şekil-23: TZP grubundan bir korneaya ait epitel dejenerasyon (siyah ok), nekroz ve kanama, x10, H-E.
Şekil-24: TZP grubu bir kornaya ait epitelde şiddetli dejenerasyon (siyah ok), x40, H-E.
Şekil-25: TZP grubundan bir korneaya ait kanama (yıldız), x20, H-E.
Şekil-26: TZP grubundan bir
korneaya ait kanama (yıldız), x40, H-E.
Şekil-27: Kombine hidrojel ve TZP grubundan bir korneaya ait
neovaskülarizasyon, 50+ yeni damar oluşumu, x10, H-E.
Şekil-28: Kombine hidrojel ve TZP grubundan bir korneaya ait
neovaskülarizasyon, 50+ yeni damar oluşumu, x20, H-E.
Epitel Kalınlık
Tablo-9: Gruplara göre histopatolojik olarak epitel kalınlıkları (µm).
Histolojik olarak epitel kalınlık ölçümleri (µm)
Grup Medyan (Aralık)
Sham 6,5 (4-13)
TZP 10 (3.5-22)
Hidrojel 8 (5.5-13)
Sitrat 6,25 (3,5-15,5) b
TZP + Hidrojel 17 (8-26,5) ab
Kontrol 5 (3,5-6) a
µm: mikrometre TZP: Trombositten zengin plazma, a: TZP+Hidrojel grubu ile kontrol grubu arasındaki istatistiksel anlamlılık, b: TZP+Hidrojel grubu ile kontrol grubu arasındaki istatistiksel anlamlılık.
Kontrol grubu dahil bütün gruplar arasında epitel kalınlıkları
karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı şekilde fark görüldü (p=0,002).
Epitel kalınlığının en fazla olduğu grup TZP+Hidrojel grubu olduğu görüldü (Tablo-9). Gruplar kendi arasında karşılaştırıldığında ise TZP ve hidrojel kombinasyonu uygulanan grupta kontrol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı şekilde epitel kalınlığının arttığı görüldü (p=0,001). Kombine tedavi uygulanan grupta, sitrat grubuna göre epitel kalınlığı istatistiksel olarak anlamlı derece fazla idi (p=0,047). İki kıyaslamalarda diğer gruplar arasında istatiksel anlamlı fark görülmedi (p>0,05).
Stromal Hücre Yoğunluğu
Kontrol grubu dahil bütün gruplar arasında stromal hücre yoğunluğu skoru karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı şekilde fark görüldü (p=0,003).
Stromal hücre yoğunluğunun en fazla olduğu grup TZP+Hidrojel grubu iken en az
olduğu grup kontrol grubu olarak izlendi (Şekil-29). Gruplar kendi arasında ikili olarak karşılaştırıldığında ise TZP ve hidrojel kombinasyonu, sham grubu ve hidrojel grubundaki stromal hücre yoğunluğunun kontrol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı şekilde arttığı görüldü (p=0,034, p=0,007 ve p=0,004). Ancak tedavi grupları arasında istatiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi (p>0,05).
Şekil-29: Gruplar arasındaki histopatolojik stromal hücre yoğunluğu farkları.
Epitel Nekrozu
Kontrol grubu dahil bütün gruplar arasında epitel nekrozu değerleri karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı şekilde fark görüldü (p=0,003). Epitel nekrozunun en yoğun olduğu grup olarak sham grubu izlendi. Tedavi grupları arasında en az olan grup TZP+Hidrojel grubu idi (Şekil-30). Gruplar kendi arasında ikil olarak karşılaştırıldığında ise TZP ve hidrojel kombinasyonunun, sitrat grubunun ve kontrol grubunun epitel nekrozunun sham grubuna göre istatiksel olarak anlamlı şekilde az olduğu görüldü (sırasıyla p=0,034, p=0,02 ve p=0,002). Diğer gruplar arasında istatiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi
Sham TZP Hidrojel
Sitrat
TZP + Hidrojel Kontrol 0
1 2 3 4
Gruplar Arasındaki Histopatolojik Stromal Hücre Yoğunluğu Farkları
Gruplar
Stromal Hücre Yoğunluğu Skoru
Şekil-30: Gruplar arasındaki histopatolojik epitel nekrozu farkları (*: p≤0,05, **:
p≤0,01, ***: p≤0,001).
Epitel Dejenerasyonu
Kontrol grubu dahil bütün gruplar arasında epitel dejenerasyonu değerleri karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı şekilde fark görüldü (p=0,048). Epitel dejenerasyonun en yoğun olduğu grup olarak hidrojel grubu izlendi (Tablo-10).
Gruplar kendi arasında ikili karşılaştırıldığında istatiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi (p>0,05).
Sham TZP Hidrojel
Sitrat
TZP + Hidrojel Kontrol -1
0 1 2 3 4