Glicogênio
As determinações de glicogênio foram realizadas como descrito por Bidinotto et al. (1997). Amostras de fígado, músculo branco e músculo vermelho eram transferidas para um tubo de ensaio contendo 1,0mL de KOH 6,0N e incubadas por cinco minutos a 100°C em Banho-Maria. Em seguida, 250µL de extrato eram transferidos para um tubo de ensaio onde eram adicionados 3mL de etanol 90% e 100µL de K2SO4 10%, seguidos de agitação. As
amostras eram centrifugadas a 3.000 x g por três minutos e o precipitado ressuspendido em 2,5mL de água destilada, seguido de agitação. Um volume adequado desta dissolução era analisado quanto ao seu teor de açúcares totais (Duboie et al., 1956). Esta análise consiste na adição de um volume adequado de dissolução a 500µl de fenol 4,1 % e 2,0mL de ácido sulfúrico concentrado, rapidamente adicionado ao meio de reação. Os tubos de reação eram imediatamente resfriados em banho de água e a leitura óptica realizada em 480nm. A concentração de açúcares totais era estimada contra um padrão de glicose 1mM e o valor está expresso em µmol de glicosil glicose/mg de tecido.
Glicose
A quantificação de glicose foi realizada através do método Glicose Oxidase (Trinder, 1969). Uma amostra de 10uL (plasma total ou extrato neutro dos demais tecidos) e 190µL de reagente do kit eram pipetados em uma micro-placa, incubados a 37°C no escuro
por 10 minutos, seguido de leitura em espectrofotômetro a 525nm, através de um leitor de micro-placas (Termomax, Molecular Devices). Seu valor está expresso em mg/g de tecido ou mg/mL de plasma.
Lactato
A quantificação de lactato (Harrower & Brown 1972) era realizada em volume adequado e pré-estabelecido de extrato ácido de plasma, fígado, músculo branco e músculo vermelho, aos quais era adicionado 20µL de CuSO4.H2O 4%, 3,5mL de ácido sulfúrico
concentrado e 80µL de p-fenilfenol (1,5g de p-fenilfenol em solução aquosa de NaOH 2%). Após uma hora, os tubos eram fervidos por 90 segundos e imediatamente resfriados em banho de gelo. A leitura era realizada contra um padrão de lactato contendo 20nmols e a leitura óptica, realizada em 570nm. Seu valor está expresso em µmol/g de tecido ou µmol/mL de plasma.
Piruvato
A quantificação de piruvato (Lu 1939) era realizada em volume adequado e pré-estabelecido de plasma ou dos tecidos preparados em extrato neutro, ao qual era adicionado 250µL de dinitrofenilhidrazina 0,1% em HCL 2,0N. Após 30 minutos de repouso, a 37º C, eram adicionados 3,0mL de NaOH 1,3N e a leitura óptica, efetuada em 440nm contra um padrão de piruvato contendo 100nmols. O valor é expresso em µmol/g de tecido ou µmol/ml de plasma.
Proteína
O teor de proteína das amostras era determinado segundo Kruger et al. (1994) em 10µL de amostras (plasma total e demais tecidos preparados em extrato neutro) aos quais eram adicionados 190µL de reativo de Bradford (100mg de Comassie blue G250 em 50mL de etanol 95% seguido de adição de 100mL de ácido fosfórico 85% e, volume completado para um litro com água destilada). Após esta mistura ser incubada à temperatura ambiente, no escuro, por 10 minutos, a leitura era feita em um leitor de micro-placas (Termomax, Molecular Devices) em 620nm contra um padrão de albumina (1mg/ml). Os valores estão expressos em mg/g de tecido ou mg/mL de plasma.
Os aminoácidos livres foram determinados segundo Copley (1941). Amostras de plasma total, ou dos demais tecidos preparados em extrato neutro, eram transferidas para um tubo de ensaio seguido da adição de 2mL de ninhidrina 0,1% em propanol. Os tubos eram vedados e colocados em Banho-Maria a 40º C por 40 minutos. Após este período, a leitura óptica era realizada em 570nm, contra um padrão de ácido aminoacético 10mM. O valor está expresso µmol/g de tecido ou µmol/mL de plasma.
Amônia
A determinação da amônia era feita segundo Gentzkow & Masen (1942). Um volume pré-estabelecido de extrato ácido (plasma, fígado, músculo branco e músculo vermelho) era transferido a um tubo de ensaio com água destilada para um volume final de 2,0mL e adicionado de 0,5mL de reativo de Nessler. A leitura óptica era realizada em 420nm contra um padrão de 100nmols de amônia. Os valores estão expressos em µmol/g de tecido ou µmol/mL de plasma.
Triglicérides
A determinação de triglicérides foi feita a partir do Kit Labtest Liquiform. Em um volume de 10µL de plasma total ou de extrato neutro dos tecidos, eram adicionados 190µL do reativo do Kit. Após esta mistura ser incubada a 37ºC por 10 minutos, a leitura das amostras ocorria em leitor de micro-placas (Termomax, Molecular Devices) em 525nm. A leitura era realizada contra um padrão de triglicérides 200mg/dL. Os valores de triglicérides das amostras estão expressos em mg/g de tecido ou mg/mL de plasma.
Ácidos graxos livres
Os ácidos graxos livres foram determinados segundo Norvák (1965). Amostras adequadas dos diferentes tecidos (plasma total e demais preparados em extrato neutro) eram adicionados a 1,0mL de solução DOLE (heptano, álcool isopropílico e ácido sulfúrico 1N na proporção de 1:4:0,1) seguido de agitação. Posteriormente, era adicionado 1,0mL de heptano e 2,0mL de água, agitando-se novamente por inversão. Uma alíquota equivalente a 600µL da fase superior era retirada e adicionada a uma mistura de clorofórmio e heptano (5:1 v/v) e 1,0mL de reagente de cobalto, constituído por 1,32 volumes de trietanolamina + 10 volumes de solução A (solução saturada de K2SO4, 6g de nitrato de cobalto e 0,8mL de ácido acético
glacial ) + 7 volumes de solução B (solução saturada de Na2SO4). As amostras eram
uma alíquota de 600µL à qual se adicionava 600µL de solução indicadora (0,4% de α-nitroso-
β-naftol em etanol, diluída 12,5 vezes). A leitura óptica era realizada em 500nm contra um padrão de ácido palmítico 4,0mM e o valor está expresso em µmol/g de tecido ou µmol/mL de plasma.