Kapsam Bakımından Etkiler

3.3.1 Reagentes e soluções

As soluções utilizadas para as digestões e curvas de calibrações foram preparadas com água destilada-deionizada (18 MΩ cm, Milli-Q®_{, Millipore, Bedford, MA, USA) e adicionado}

ácido nítrico de alta pureza (Fisher, Pittsburgh, PA, USA). As soluções de calibração foram preparadas a partir de diluições de solução padrão 1000 mg L-1 _{de Cr, Mg e Mn (SPEX}

CertPrep, Metuchen, NJ, USA). Peróxido de hidrogênio 30% v v-1 (Acros, Morris Plains, NJ, USA) e ácido nítrico forma utilizados nas digestões. Todos os materiais utilizados foram descontaminados em solução de ácido nítrico (10% v v-1) por 24 h.

Todas as amostras de placentônio foram coletadas em um frigorífico no município de Ilha Solteira – SP. Os animais escolhidos foram de diferentes regiões para verificar as concentrações em diferentes condições nutricionais, no qual permite uma coleta de amostra de maneira não tendenciosa.

3.3.2 Coleta e preservação das amostras

Foram coletadas amostras de placentônio em 6 distintas bovinos em diferentes fases de gestação de animais enviados para o abate, Figura 3.1 (a). A coleta foi realizada com um bisturi n. 2 e os placentônios acomodados em frascos de amostragem e numerados de 1 a 6. Após a coleta, as amostras foram congeladas em um refrigerador doméstico a -5°C e submetidas a liofilização para preservação das amostras. A liofilização foi realizada a – 50 °C por compressor hermético com gás, durante 48 h em um liofilizador Terroni® LS 3000 construído em aço inox AISI 304, com polimento sanitário espelhado, ventilação forçada a ar, proteção térmica e sistema de drenagem com válvula de esfera acoplado à bomba de vácuo, Figura 3.1 (b).

Figura 3.1 - Procedimento de coleta e preservação de amostras realizados. Coleta de material (a). Etapa de liofilização de amostras (b).

(a)

(b)

Fonte: Elaborado pelo autor

Na maioria dos casos de quantificação de tecidos de origem animal a liofilização pode ser bastante útil para preservação de amostras, com o princípio de congelamento e desidratação a baixa temperatura com alto vácuo, preservando o tecido que está sendo desidratado 77_.

Após a liofilização as amostras foram submetidas a digestão. Com o intuito de garantir a homogeneidade das amostras e eficiência da etapa de digestão, foi realizado uma moagem criogênica, utilizando um moinho criogênico SPEX 68000, com o programa de moagem demonstrado na Tabela 3.1.

A diminuição da dimensão das partículas de uma amostra é um componente importante para digestão via micro-ondas. O emprego da moagem criogênica com nitrogênio líquido é um meio eficiente e dinâmico de obter partículas com volume ultrafino e uniforme, enquanto promove melhor condição e a estabilidade para a amostra, bem como aumenta a eficiência de

digestão 78_{. Sistemas de moagem criogênica combinam a moagem fina de alto desempenho com}

o resfriamento criogênico, em adequar um ambiente inerte para preservação da amostra e facilitar a etapa de digestão assistida por micro-ondas, figura 3.2.

Tabela 3.1 - Programa de moagem criogênica empregado para as amostras.

ETAPA TEMPO (minutos)

Pré-congelamento 2

Moagem a 3

Congelamento entre as moagens 2

a _{2 ciclos por moagem}

Fonte: Elaborado pelo autor

Figura 3.2 - Amostras de placentônios tritutadas e preservadas para digestão via microondas.

Fonte: Elaborado pelo autor

3.3.3 Digestão via micro-ondas

A busca por melhores condições de digestão é bastante discutida, pois, esta etapa é uma das mais importante para uma análise efetiva. Quando se trata de matriz biológica, a quantidade elevada de compostos orgânicos não digeridos podem se reorganizar formando organometálicos e causa sérias interferências analíticas. A digestão de amostras via micro- ondas é uma alternativa na qual pode ser utilizado para a digestão, combinados com misturas oxidante de HNO3 e H2O2. Este procedimento é uma opção rápida e viável pelo fato de

possibilitar a recuperação de HNO3 durante a etapa de aquecimento em frascos fechados 79,80.

O aumento da pressão interna nos tubos, durante a rampa de aquecimento causa o aumento do ponto de ebulição da solução a ser digerida, consequentemente, acelera as reações químicas de digestão de compostos orgânicos conforme descrito nas reações 1 - 4 81,82,83:

(CH2)n + 2HNO3 (aq)  CO2 (g) + 2NO (g) + 2H2O (l) (1)

Na reação abaixo o NO (g), resultante da reação 1, reage com o O2 (g) (H2O2 (aq))

presente no sistema para formar o NO2 (g):

NO (g) + H2O2 (aq)  NO2 (g) + H2O (l) (2)

Em seguida, o NO2 (g) é reabsorvido dentro do sistema e ocorre a formação de HNO3

(aq) e HNO2 (aq):

2NO2 (g) + H2O (l)  HNO3 (aq) + HNO2 (aq) (3)

Este ciclo irá continuar enquanto houver O2 (g) disponível no sistema. Por tanto, quanto

maior a quantidade de oxigênio disponível, maior será a recuperação de HNO3 e mais eficiente

será a digestão. Neste caso a adição de H2O2 contribui para melhora na oxigenação do sistema.

2HNO2 (aq) + H2O (l)  NO2 (g) + NO (g) + 2H2O(l) (4)

Para a digestão das amostras de placentônios, aproximadamente 0,25 g foram submetidas a digestão assistida por micro-ondas, empregando 2,5 mL de HNO3, 1,5 mL de H2O (Millipore

Rios 5®) e 1 mL de H2O2 em um forno micro-ondas Multiwave Anton Paar®, equipado com

rotor de 6 posições. Após a etapa de digestão os digeridos foram aferidos para 25 mL e seguidos para quantificação.

A verificação de precisão analítica, o mesmo procedimento foi realizado com a CRM 1577b. O programa de aquecimento para digestão é descrito na tabela 3.2.

Tabela 3.2 - Programa de aquecimento usado para a digestão das amostras.

Etapa Potência (W) Temperatura (K) Tempo (min) Pressão (Bar) 1 100 393 5 75 2 600 510 5 75 3 1000 560 10 75 4 0 298 15 75

3.3.4 Quantificação de Cr e Mn por WC AES

O WC AES foi utilizado para medidas analíticas com a introdução de 25 L de amostras adicionadas diretamente no atomizador de tungstênio usando uma micropipeta automática (Eppendorf 10 – 100 mL, Brinkman, Westbury, NY, USA). O ciclo de aquecimento aplicado consiste nas etapas de vaporização do solvente (etapa 1), pirólise da amostra (etapa 2), pré atomização (etapa 3) e excitação e atomização do analito (etapa 4) 29,33.

O filamento de tungstênio utilizado foi proveniente de uma lâmpada comercial de microscópio (Osram Xenophot 64633 HXL, Pullach, Germany), com 15 V e 150 W e aplicação de uma corrente contínua. Cerca de 25 L de amostras foram inseridos na cela de atomização (Ace Glass, product no. D131703, Vineland, New Jersey, USA) para as etapas de secagem, pirólise e atomização 33. A emissão gerada foi coletada por espectrômetro modelo Czerny- turner (MonSpec 18, Scientific Measurement Systems Inc., Grand Junction, CO, USA) com tempo de integração de 30 ms, acoplado a um detector CCD (Spec-10, Princeton Instruments, Roper Scientific, Trenton, NJ, USA) operando em - 40 °C, que possibilita adequanda resolução espectral 84_.

Avaliações de diferentes tempos de integração de sinais de emissão foram realizadas com a finalidade de reduzir o sinal-ruído e aumentar a sensibilidade analítica. Um MIP OES (MP AES 4200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) foi utilizado para checar a exatidão dos dados obtidos. O sistema de introdução de amostras é composto por um amostrador automático SPS 3 - tubulação de fotopolímero-resistente, uma câmara tipo ciclone juntamente com um nebulizador inerte OneNeb e N2 utilizado como gás de plasma 85. O método de curva

de calibração externo foi utilizado em todas as determinações. Para verificar a exatidão analítica, amostra certificada de fígado bovino CRM 1577b foi utilizada como referência. A Figura 3.3 demostra o procedimento analítico adotado para as determinações.

Figura 3.3 - Procedimento adotado para determinação de Cr e Mn em placentônios bovinos.

Fonte: Elaborado pelo autor