ITS (Internal Transcribed Spacer) ve rDNA

Bazı sebeplerden dolayı bitki türlerinin doğal ortamlarda tanımı ve teşhisinde zorluklar yaşanmaktadır. Anahtarlarda kullanılan fenetik karakterler bazen ayırt edici olmamakla birlikte yanıltıcı olmaktadır. Yapılan pek çok araştırma bazı bitkilerin yanlış tanım ve teşhisinin olduğunu bulmuştur. Moleküler biyolojideki son yapılan çalışmalarda türe özgü gen bölgelerinin bulunmasıyla bitki türlerinin teşhis edilmesine yardım etmiştir. Bu sebepten rDNA’nın ITS bölgeleri, bitki moleküler sistematik çalışmalarda sıklıkla başvurulan yöntemlerdir (Baldwin ve ark., 1995). ITS, iki iç boşluk ITS-1 ve ITS-2, 5,8S, 18S ve 26S nüklear ribozomal RNA (nrRNA) alt ünitelerini kodlayan genlerin arasına yerleşmiştir. ITS-1 ve ITS-2 yaklaşık 300 bç uzunluğundadır. 5,8S alt ünitesi ise 164 bç uzunluğundadır (Baldwin, 1992). ITS bölgesinin her iki tarafında korunmuş diziler vardır. Bu sebepten evrensel primer olarak kullanılır. Ayrıca PCR çalışmalarında kolayca elde edilebilmektedir (Baldwin, 1992). Bu amaçla kullanılan evrensel ITS primerlerinin rDNA üzerideki bağlanma bölgeleri şekilde gösterilmiştir. rDNA genleri, kopya edilemeyen bölgeleri (IGS) ve ITS bölgelerinin varlığı ile birbirinden ayrılmıştır. IGS bölgeleri, komşu rDNA tekrar birimler arasında yer alır. ETS, ribozomal mRNA ile kodlayan dış kopya bölgesidir ve onun promotor bölgesini ihtiva eder. NTS ise tekrar birimler arasına yerleşmiş kodlanmayan bölgedir (Baldwin ve ark., 1995).

Şekil 3.1. Çekirdek ribozomal DNA’sının tekrarlı üniteleri (Dayle ve ark., 2001).

3.2.1. ITS’nın Genel Özellikleri

a- Ökaryot organizmalarda 5,8S gen bölgesi, çoğunlukla ITS bölgeleri ile birlikte değerlendirilir. Bütün bir bölgenin uzunluğu yaklaşık 600 ile 700 bç arasındadır. b- ITS bölgeleri, rDNA'nın, 18S, 5,8S ve 28S alt birimlerinin oluşumu sürecinde rol

alır.

c- Bu bölgenin korunmuş rDNA bölgesine göre fazla değişim gösterdiği belirtilmiştir. Bu sebepten ITS filogenetik çalışmalarda bize çözüm yolu sunmaktadır (Baldwin, 1992).

3.2.2. ITS Bölgesinin Filogenetik Çalışmalarda Kullanılışı

ITS bölgeleri filogenetik ve biyocoğrafik çalışmalarda yoğun olarak kullanılmaktadır. Bunun sebebi bu bölgeler filogenetik çalışmalarda yeterli veri verebilecek büyüklüktedir. Cins ve tür seviyesindeki çalışmalar için ileri derecede korunmuş rDNA bölgelerine komşudur. Bazı bitki gruplarında ITS1 ve ITS2’de yüksek oranda varyasyonlarla karşılaşırken, bazılarında nükleotit varyasyonun az bir dizisine rastlanmaktadır. Çoğu gruplarda ITS dizilerinin, cpDNA baz dizinlerinden çok daha fazla değişkenlik gösterdiği ve daha bilgi verici olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca genomik DNA da yüksek kopyaya sahiptirler. Homolog olmayan kopyaları nokta mutasyonu ve delesyon şeklinde bulunabilmekte ve bir türün bireyleri arasında küçük varyasyonlara sebep olmaktadır. Ayrıca ITS bölgelerinin küçük boyutta olması

sebebiyle PCR ile kolayca çoğaltılabilmektedir. Bu sebepten filogenetik çalışmalarda sıklıkla tercih edilmektedir (Baldwin, 1992).

3.2.3. Filogenetik Analiz ve Ağaç Oluşturma

Filogeni kısaca; evrimsel akrabalık ilişkisi olarak tanımlanabilir. Filogenetik analiz ise; mevcut olan karakterlerin değişik kriterler kullanılarak değerlendirilmesi sonucu taksonlar arasındaki akrabalık ilişkilerinin ortaya çıkarılmasıyla soy ağaçlarının oluşturulmasıdır (Saitou and İmanishi, 1989). Filognetik ağaç bir grubun evrimsel tarihinin grafiksel özetidir.

Filogenetik ağaç;

a- Dallanma olaylarının modelini, bazı durumlarda zamanını ve zaman aralığını tanımlar,

b- Türleşme sırasını kaydeder,

c- Hangi taksonların yakın ya da uzak akraba olduklarını gösterir (Şahin, 2011).

3.2.4. Filogenetik Ağacın Değerlendirilmesi

Filogenetik bir ağaçta; dallar; türlerin atasal populasyonlarının zaman içerisindeki durumlarını gösterir. Düğümler; bir populasyonun (taksonun) iki veya daha fazla türev populasyona ayrıldığı noktalara denir. Dal uçları ise; soyu tükenmiş veya bugün yaşayan türleri ifade eder. Filogenetik ağaçlar köklü veya köksüz olabilir. Köklü Ağaçlar; inceleme altındaki soy hattını nereden köklendiğini tanımladığı için ayrılma olaylarının açığa çıkma sırasını da ortaya koyarlar (Freeman and Herron, 1999). Köksüz ağaçlar ise; köklü ağaçların tersine, türler arasındaki ilişkiyi ortaya koyar. Fakat, hangi düğüm ya da dalların tarihte önce veya sonra açığa çıktığına işaret etmez (Başıbüyük ve ark., 2000). Ağaçlardaki dal uzunluğu genellikle dalda oluşmuş değişikliklerin (basamakların) sayısını belirler (Mount, 2001).

Filogenetik ağaç oluşturulurken genellikle üç yöntem kullanılır. Bu yöntemlerden ikisi karakter temelli yöntemler olarak bir başlık altında toplanabilen Maksimum parsimoni (MP) ve Maksimum Benzerlik yöntemleridir. Diğeri ise uzaklık yöntemidir. Bu çalışmada karakter temelli yöntemlerden Maksimum Parsimoni (MP), Maksimum benzerlik (ML); mesafe temelli yöntemlerden ise Neighbor joining (NJ),

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) yöntemleri kullanılmıştır.

3.2.4.1. Maksimum Parsimoni (MP) ve Maksimum Likelihood (ML)

Maksimum Parsimoni, en eski, en basit ve en sık kullanılan metotlardan biridir. İncelenen diziler ya da genetik uzaklıklar ile uyumlu bir ağaç elde etmek için gerekli en az mutasyonların saptanmasına yarayan bir yöntemdir. MP minimum evrensel metod (parsimoni = tutumluluk) olarak tanımlanabilir. Bu yöntem türler arasındaki farklılığı en iyi şekilde ifade etmektedir (Freeman ve Herron, 1999). Ağaçların çiziminde kullanılan genetik mesafe nükleotit değişim oranları yardımıyla da hesaplanabilmektedir. MP analizi ile en iyi sonuçlar dizi çiftlerinin arasındaki benzerliklerin çok güçlü olduğu ve az sayıda dizinin olduğu durumlarda alınır (Sevindik, 2014).

En yüksek ihtimal metodunda, tüm ağaç topolojileri değerlendirilir. Neticede, yarışan ağaç topolojilerinden en yüksek gerçekleşme olasılığı olan ağaç seçilir.

Maximum likelihood yönteminin avantajları:

a- Mevcut metodların içinde genelde en tutarlı olanıdır. b- Karakter ve oran analizlerinde kullanılabilirler.

c- Sönmüş (hipotetik) ataların sekanslarını tahmin etmede kullanılabilir. d- Nükleotid, aminoasit sekansları ve diğer data tiplerine uygulanabilir.

Bütün bu avantanjlarının yanında Maximum Likelihood metodu, basit ve sezgisel olmayışı, parsimonide olduğu gibi yüksek seviye homoplasilerde yanılabilmesi ve parsimoni metoduna göre daha yavaş olması gibi dez avatanjlara sahiptir (Başıbüyük ve ark., 2000).

3.2.4.2. Neighbor Joining (NJ) ve Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA)

Mesafe temelli yöntemlerde ağaç oluşturmak için temel alınan dizinin türler arasındaki hizalanmasıyla görülen benzersizliklerden yararlanılır. Genetik mesafeler her

tür arasındaki mesafe matrisini oluşturmak için kullanılır. Bu matristeki çiftler temelli uzaklık skorları kullanılarak filogenetik ağaç oluşturulur.

En basit kümelenme metodu olan UPGMA ard arda kümelenerek filogenetik ağacı oluşturur. Genetik mesafeler ile birbirinden ayrılan taksonlara, işlevsel taksonomik birimler adı verilir. UPGMA bu birimlerin birbirleri ile olan mesafe matrisini kullanmaktadır (Çınar Kul, 2010).

Komşu birleştirme yöntemi (NJ) Saitou ve Nei (1987) tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde ise ağacı oluşturmak için birbirine en yakın mesafedeki türleri kullanmasıyla algoritmalar ile aynı olmasına karşın bunlardan farklı olarak türlerin kökten eşit uzaklıkta olduğu varsayımı temel alınmaz. Bütün türleri tek çatı altında toplayarak ağaç oluşturmaya başlar. Daha sonra mesafenin en kısa olduğu iki türü bir çatı altına alarak kademeli olarak ilk oluşturduğu tek çatıyı bozar. Bu yeni oluşan küme matristen bir türü çıkarılır ve bundan sonra gelen birbirine en yakın türleri çatıya ekler (Sevindik, 2014).

4. MATERYAL VE YÖNTEM