İttihatçılar

As análises iniciais de etanol neste trabalho foram realizadas nas mesmas condições que aquelas utilizadas por De Martinis e colaboradores (2004 e 2006) para amostras de fluidos biológicos. Na ocasião, foi utilizado um cromatógrafo a gás da marca Varian CP 3380 (Varian, Inc.Palo Alto, CA, USA) equipado com detector de ionização de chama e coluna capilar de sílica fundida Carbowax (30m x 0,25mm I.D., espessura 0,25 µm; Chrompack). As

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 50 100 150 200 250 300 Σ ân io n s ( eq /L) Σ cátions (eq/L)

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condições analíticas foram: uso do padrão interno (mistura de 1g/L de NaCl e 300 µL/L de isobutanol; aquecimento por 10 min a 80ºC antes da injeção da amostra; temperatura do injetor de 220ºC e do detector de 300ºC; rampa de aquecimento iniciando a 40ºC (4 min) até 220ºC (2 min) com razão de aquecimento de 15ºC min-1_.

Cerca de 9 curvas de calibração foram construídas utilizando padrão interno em diversas concentrações. A Figura 13 traz um exemplo de curva analítica utilizando 34,6 µmol/L de isobutanol e concentração de etanol de 0 a 80 µmol L-1. A baixa linearidade do método (r = 0,885) ocorreu por causa da baixa reprodutibilidade da área do pico referente ao isobutanol. A utilização de apenas a área do etanol (sem fazer a razão com o padrão interno) também se mostrou inadequada (r =0,6186) (Figura 14).

A diluição do padrão interno não resultou em melhora da linearidade, pois a área referente ao pico de etanol também variou de forma irregular, além da possibilidade de alteração no coeficiente de partição. Suspeitou-se da contaminação do isobutanol com etanol e, portanto, optou-se por elaborar uma curva de calibração por padronização externa, no entanto, a linearidade ainda foi insatisfatória.

Figura 13: Exemplo de curva analítica de calibração utilizando 34,6 µmol L-1 _de isobutanol como padrão interno.

1,00E-03 1,50E-03 2,00E-03 2,50E-03 3,00E-03 3,50E-03 4,00E-03 4,50E-03 5,00E-03 0 20 40 60 80 Api/ AetOH etanol (mol L-1)

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Figura 14: Exemplo curva analítica de calibração elaborada por padronização externa, utilizando as mesmas áreas de etanol obtidas na curva representada na Figura 13.

Outra suspeita recaiu sobre a possibilidade da atmosfera do laboratório estar contaminada com etanol, contaminando os frascos e padrões de forma aleatória. Desta forma, a preparação dos padrões foi realizada de forma bastante rigorosa. Inicialmente, uma pequena alíquota foi transferida do frasco original de etanol de 5 litros para um frasco de vidro com capacidade de 10 mL, que foi fechado com batoque e tampa de rosca. Somente esse frasco de etanol, pelo menos um dia após sua preparação, é que era levado até o ambiente (relativamente isolado) para a preparação dos padrões. A água ultrapura utilizada nas diluições foi previamente fervida por 10 minutos sob agitação para eliminar os possíveis compostos orgânicos voláteis solubilizados. Esta foi armazenada em frascos de vidro deixando o mínimo de headspace, e fechados com batoque e parafilme ao redor da tampa. Os frascos com água foram guardados em geladeira por no máximo 24 horas antes do uso.

Para verificar se havia contaminação de etanol no frasco ou nos constituintes do sistema cromatográfico, foram feitas análises do frasco vazio, da água ultrapura fervida e não fervida. Notou-se a presença de etanol tanto no frasco vazio quanto em ambas as alíquotas de água ultrapura. Assim, acredita- se que o etanol poderia estar presente no sistema (seringa, e/ou injetor), já que quando injetado manualmente apenas ar não foi detectada a presença de etanol. 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 20 40 60 80 AetOH etanol (mol L-1)

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Uma nova curva analítica foi construída, realizando as análises de cada ponto em triplicata (Tabela 6). Nota-se que quando maiores cuidados foram tomados para minimizar a contaminação durante o preparo dos padrões houve melhora na coerência do sinal versus concentração (Figura 15). No caso da concentração de 80 mol L-1 de etanol, por razão desconhecida, o sinal excedeu o valor esperado (não apresentou proporcionalidade entre concentração e área), e este foi removido para o cálculo da reta. A equação da reta obtida foi y = 124,7 x [etanol] – 7,17, com coeficiente linear de 0,8815.

O sinal do branco foi observado mesmo após a troca e lavagem da seringa. O sistema de injeção foi limpo passando ar e injetando água diversas vezes, da mesma forma utilizada para as amostras, mas ainda assim, houve sinal para o branco. Desta forma, optou-se por subtrair o valor do branco, pois este foi relativamente baixo quando comparado com o primeiro ponto da curva.

Tabela 6: Concentrações de etanol e as respectivas áreas utilizadas para construção da curva analítica

Curva analítica

Etanol (mol L-1_{) área Média ± dp % dpr} 416 0 250 310 ± 91,8 0,9 265 1268 8 1034 1.374 ± 403,6 4,0 1820 2387 20 3872 2.757 ± 984,0 9,8 2011 3916 40 3787 3.428 ± 736,9 7,4 2580 9694 60 9360 8.445 ± 1.882 18,8 6280 13253 80 16010 15.631 ± 2.212,9 22,1 17630

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Figura 15: Curva analítica de etanol após preparação rigorosa dos padrões e com maior controle da contaminação. A reta foi traçada e a equação calculada excluindo o ponto de 80 mol L-1_.

Em 2012, novo cromatógrafo a gás da marca Agilent GC 7890 A (Agilent Technologies) foi disponibilizado para uso. Desta forma houve a necessidade de iniciar um novo trabalho de otimização.

Foi realizada um análise por isoterma (120ºC) utilizando soluções aquosas de isobutanol como padrão interno (1g L-1 NaCl e 300L L-1 isobutanol) e etanol para verificar o tempo de retenção dos mesmos. Porém os picos se coeluíram (Figura 16). 0 30 60 90 0,0 8,0x103 1,6x104 Á rea etanol (mol L-1)

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Figura 16: Cromatograma de uma mistura de etanol (6 mol L-1 _{) e isobutanol (30 mol} L-1_{) por isoterma à 120ºC. Instrumento Agilent GC 7890 A (Agilent Technologies).}

Como um último teste para verificar a eficiência do uso do padrão interno para a quantificação de etanol utilizando novo equipamento, foi feita nova injeção utilizando uma rampa de aquecimento diferente da usada em 2011. Uma mistura contendo 6 mol L-1 _{de etanol e 30 mol L}-1 _{de padrão interno foi} injetada no cromatógrafo a 50ºC (2 min), posteriormente aqueceu-se o forno em 20ºC min-1 até 105ºC, e depois até 180ºC com uma razão de aquecimento de 40ºC min-1 _{(Figura 17).}

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Figura 17: Cromatograma de uma solução contendo padrão de etanol (6mol L-1_{) e} padrão interno (30 mol L-1_{), utilizando rampa de aquecimento. Instrumento Agilent GC} 7890 A (Agilent Technologies).

Apesar de haver uma boa separação entre os picos de etanol e o isobutanol (Figura 17), continuou sendo observado que a área do isobutanol variava e perdia sua função como padrão interno. O pico anterior ao isobutanol não foi identificado, podendo ser algum contaminante presente no próprio isobutanol. Portanto, optou-se pela curva analítica de calibração por padronização externa numa faixa de concentração mais baixa que as tentativas anteriores, isto é, de 0 a 12 mol L-1_{. Mantendo-se o rigor na preparação das} soluções e limpeza dos frascos e do sistema, foi possível obter dados melhores quanto a regularidade da área dos picos de etanol (Figura 18). A equação da reta obtida foi y = 440,4 x [etanol] + 132,5; com coeficiente linear de 0,9991. Ao comparar o método antigo (Tabela 6 e Figura 15) com o método atual (Figura 18), nota-se um aumento na sensibilidade de aproximadamente quatro vezes.

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Figura 18: Curva analítica de calibração utilizando padrões de etanol sem o padrão interno (Agilent GC 7890 A).

O cromatograma mostrado na Figura 19 demonstra a boa definição do pico de etanol sem o uso de padrão interno, além da ausência de importantes picos de contaminantes.

Figura 19: Cromatograma de padrão de etanol (6mol L-1_{) utilizando rampa de} aquecimento. Instrumento Agilent GC 7890 A (Agilent Technologies).

As replicatas foram sempre realizadas em frascos distintos, porém foram realizados testes para avaliar a possibilidade de injetar várias vezes alíquotas

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 0 2 4 6 8 10 12 Á re a etanol (mol L-1₎

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de uma mesma amostra contida em um mesmo frasco. Observou-se que após a terceira injeção do mesmo frasco (contendo 2mol L-1 de etanol), a área correspondente ao etanol variava muito (dpr> 16%). Considerando que todo o etanol passa para a fase de vapor na temperatura de 80ºC durante 15 minutos de aquecimento, a concentração de etanol deve diminuir com o número de injeções, pois haverá um menor número de mols na fase de vapor após cada injeção.