Os resultados deste estudo até o momento sugerem a inibição de Gsk3 como uma
possível modificação farmacológica relacionada com o aumento de Ncs-1 no córtex frontal de
camundongos e em células da linhagem PC12. Vale ressaltar que em 2008 foram publicados
resultados mostrando que o efeito ansiolítico e antidepressivo do Li (em modelos animais) é
dependente do complexo de sinalização formado por βarr2/PP2A/Akt (BEAULIEU;
MARION; et al., 2008a). Este estudo ainda mostrou que o Li perde seu efeito inibitório sobre
Gsk3β em animais deficientes de formação do complexo βarr2/PP2A/Akt. Esses achados,
além de revelar um interessante mecanismo de ação do Li envolvendo D2R, βarr2, PP2A e
Akt, também reforça a teoria de que a inibição de Gsk3 está fortemente relacionada com o
benefício terapêutico em doenças neuropsiquiátricas. Recentemente, resultados ainda não
publicados originados do laboratório do Prof. Dr. Beaulieu têm mostrado que outros fármacos
estabilizadores do humor, como VPA e LTG, dependem da integridade do complexo
βarr2/PP2A/Akt para inibir Gsk3β e ter eficácia ansiolítica e antidepressiva em camundongos.
Baseando-se nestas evidências, acredita-se que a via de sinalização βarr2-PP2A-Akt-Gsk3β
possa desempenhar um papel chave para ocorrência dos efeitos terapêuticos de fármacos
estabilizadores do humor.
A hipótese levantada por este estudo foi que a inibição de Gsk3β poderia estar
associada com a indução dos níveis de Ncs-1, observada após o tratamento com Li e VPA.
Para avaliar esta hipótese, foi realizado um novo tratamento crônico com Li e VPA em duas
linhagens de camundongos que, no entanto, não causaria nenhum efeito sobre a atividade de
Gsk3β devido a uma modificação genética. Com esta finalidade, foram empregados animais
nocautes para βarr2 e D2R. A ausência constitutiva de qualquer uma destas proteínas é
efeito dopaminérgico e de FEHs sobre a função de Gsk3β (BEAULIEU et al., 2008; dados
não publicados). Se os fármacos não mais apresentarem efeito sobre a expressão de Ncs-1
nestas condições, seria uma evidência de que a ação de FEHs testados dependeria da ação em
Gsk3β para sortir efeitos sobre a expressão de Ncs-1.
Para excluir a possibilidade de que as linhagens de camundongo nocautes βarr2 e D2R
(βarr2-/- e D2R-/-, respectivamente) possuíssem níveis alterados de Ncs-1 e consequentemente
mascarar os resultados obtidos do tratamento farmacológico, o córtex frontal de animais da
mesma ninhada (βarr2 x WT; D2R x WT) foi removido para as análises de western blot.
Nenhuma diferença estatística foi encontrada quando comparou-se os níveis de
expressão de Ncs-1 entre animais selvagens, βarr2 e D2R (Figura 39).
Em seguida, o tratamento crônico em animais βarr2-/- e D2R-/- com estabilizadores do
humor foi realizado da mesma forma como reportado previamente em animais selvagens. A
saber, Li (0,12% por dia administrado na água, ingestão livre, n = 5 animais), VPA
(misturado a ração que corresponde a 25 mg/kg por dia, ingestão livre, n = 5 animais) e LTG
(20 mg/kg por dia dissolvido em água e tween 1%, i.p., n = 5 animais) por 15 (Li) ou 21
(VPA e LTG) dias consecutivos. Neste regime, os animais foram decapitados no fim do
último dia de tratamento (15° ou 21° dia) e o córtex frontal foi removido para as análises
posteriores. Apenas a LTG aumentou a expressão de Ncs-1 em 72% no córtex frontal de
animais βarr2-/- (p < 0,05) (Figura 40). Estes resultados indicam que a formação do complexo
βarr2/PP2A/Akt é fundamental para que Li e VPA possam aumentar a expressão de Ncs-1 no
córtex frontal de camundongos. Possivelmente, esta perda de efeito farmacológico sobre a
expressão de Ncs-1 seja devido a ausência do efeito dos fármacos sobre a atividade de Gsk3β
βarr2 D2R 0.0 0.5 1.0 1.5 WT KO Nc s -1 / β -a c tin a (re la tiv o a o c o n tro le ) Ncs-1 Actina
Figura 39. Camundongos nocautes de βarr2 e D2R não possuem níveis alterados de Ncs-1 no córtex frontal. Representação gráfica da análise densitométrica e western blot da expressão de Ncs-1 (normalizada pelos níveis de actina) no córtex frontal de animais da linhagem C57 B/L selvagem (WT, N = 5 animais) ou nocautes (KO) para βarr2 (N = 5 animais) e D2R (N = 5 animais). Para todos as análises de densitometria, os resultados estão apresentados como unidades arbitrárias normalizadaspela expressão de Ncs-1/actina encontrado no grupo de animais WT de mesma ninhada originados pelo acasalamento entre heterozigotos. βarr2: beta arrestina 2; D2R: receptor de dopamina tipo 2. Os resultados nos gráficos representam a média ± SEM (t teste).
βarr2-/-
Lítio Valproato Lamotrigina 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 * Nc s -1 / β -a c tin a (re la tiv o a o c o n tro le ) D2R-/-
Lítio Valproato Lamotrigina 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Controle Tratado Nc s -1 / β -a c tin a (re la tiv o a o c o n tro le ) A C Ncs-1 Actina Ctrl Li Ctrl VPA Ctrl LTG βarr2-/- B D Ncs-1 Actina Ctrl Li Ctrl VPA Ctrl LTG D2R-/-
Figura 40. Tratamento crônico com Li e VPA não modulam a expressão de Ncs-1 no córtex frontal de camundongos nocautes para βarr2 e D2R. Os animais da linhagem C57 B/L nocautes (KO) para βarr2 e D2R foram expostos ao Li (0,12% por dia administrado na água, ingestão livre, N = 5), VPA (misturado a ração que corresponde a 25 mg/kg por dia, ingestão livre, N = 5) ou LTG (20 mg/kg por dia dissolvido em água e tween 1%, i.p., N = 5) por 15 (Li) ou 21 (VPA e LTG) dias consecutivos. Para cada fármaco testado, um grupo de 5 animais administrado com o veículo de diluição do composto correspondente foi utilizado como grupo controle. (A e B) Representação gráfica da análise densitométrica e western blot da expressão de Ncs-1 (normalizada pelos níveis de actina) no córtex frontal de animais βarr2-/- ou D2R-/- (C e D) após o tratamento. Para todos as análises de densitometria, os resultados estão apresentados como unidades arbitrárias normalizadaspela expressão de Ncs-1/actina encontrado no grupo controle correspondente. Ctrl: controle; Li: cloreto de lítio; VPA: valproato de sódio; LTG: lamotrigina. Os resultados nos gráficos representam a média ± SEM. * p < 0,05 (t teste).
4.1.8 TDZD-8, um inibidor específico de Gsk3, aumenta a expressão de Ncs-1 in vitro e in