4. RÜZGÂR TRENDİ BELİRLEME ÇALIŞMALARI
4.2 Rüzgâr Trendi Analizleri
4.2.7 İstasyonların Eş Zamanlı Rüzgâr Hızı Analizi
A avaliação do status antioxidante de tecidos cerebrais foi feita de acordo com
diversos protocolos disponíveis na literatura ou como recomendado pelos fabricantes de kits
comerciais. Neste intuito, foram investigados os níveis de CAT (catalase), SOD (superóxido
dismutases), TBARS (lipoperoxidação pela produção de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico), carbonilação de proteínas, além da atividade enzimática de CK (caseína
quinase), succinato desidrogenase (SDH) e complexos mitocondriais I, II, II-III e IV.
As estruturas cerebrais foram homogeneizadas em tampão SETH (sacarose 250 mM,
EDTA 2 mM, trizma base 10 mM e heparina 50 UI/mL) (1:10, p/v, pH 7,4). Os
homogeneizados foram centrifugados a 800 × g durante 10 minutos e os sobrenadantes
mantidos a -70 °C até a determinação bioquímica. O período máximo entre a preparação do
homogeneizado e a análise foi sempre inferior a 5 dias. Para estes experimentos, a
amostra. Para isso, foi utilizado o método descrito por Lowry et al. usando albumina bovina
como padrão (LOWRY et al., 1951).
3.14.1 Catalase (CAT)
A determinação da atividade da catalase (CAT) foi detectada
espectrofotometricamente de acordo com o método descrito por Aebi (AEBI, 1984). Em uma
cubeta de quartzo, 10 µL da solução de reação foi diluída em 990 µL de Tris/EDTA 5 mM,
pH = 8,0, peróxido de hidrogênio (H2O2) a 30% e água MilliQ. A atividade desta enzima foi
medida pela velocidade de decomposição do peróxido de hidrogênio, em comprimento de
onda de 240 nm. A absorbância foi mensurada em espectrofotômetro a 240 nm por 5 minutos
a 30 oC e os resultados foram expressos em µmol de H2O2 consumido/mg tecido.
3.14.2 Superóxido dismutase (SOD)
O ensaio para quantificar a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi
baseado na auto-oxidação da adrenalina como proposto por Misra e Fridovich em 1972
(MISRA; FRIDOVICH, 1972). Neste ensaio, quando a adrenalina sofre auto-oxidação em
meio básico, a reação envolve a geração de radicais livres, especialmente o ânion superóxido,
que contribui com a perpetuação da oxidação. Para tanto o método avalia, indiretamente, a
ação enzimática da SOD, que ao neutralizar os radicais superóxido evita a oxidação da
adrenalina a adrenocromo, um subproduto colorido que pode ser medido a 480 nm.
Inicialmente realizou-se uma leitura em espectrofotômetro da auto-oxidação natural da
adrenalina, em meio contendo tampão glicina pH 11,3, por cerca de 90 s. A leitura resultou
curva, a partir de onde observa-se um decaimento que indica a oxidação deste em outros
compostos com absorção máxima não mais em 480 nm, e por isso não detectáveis. As
absorbâncias interessantes são aquelas do início e fim do segmento da curva mais acentuado,
representando o período mais intenso da reação. Após, realizou-se a leitura das amostras em
meio contendo tampão glicina pH 11,3, ou adrenalina. Os resultados foram expressos em,
unidades de SOD por miligrama de proteína, que representa a quantidade de enzima capaz de
inibir em 50% a velocidade de auto-oxidação da adrenalina.
3.14.3 Peroxidação de lipídios
Um dos métodos para se quantificar os produtos da peroxidação lipídica é o método de
análise da formação de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) descrito por
Draper e Hadley (DRAPER; HADLEY, M., 1990). Este método consiste na análise dos
produtos finais da peroxidação lipídica (peróxidos lipídicos, malondialdeído, e outros aldeídos
de baixo peso molecular) que, ao reagirem com o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), formam bases
de Schiff.
Alíquotas do sobrenadante (homogeneizado) foram misturadas em tampão fosfato de
sódio (pH 7,4) em tubos de ensaio e agitados no vórtex por 15 segundos. Em seguida um dos
tubos foi colocado em banho-maria a 37 oC com agitação de 1 minuto a cada 10 minutos e o
outro tubo na geladeira, ambos pelo período de 1 h. Após retirá-los do banho e da geladeira,
foram adicionados a cada tubo uma solução composta de TCA (ácido tricloroacético), TBA
(ácido tiobarbitúrico) e BHT (hidroxitolueno butilado) diluídas em HCl 0,25N. Em seguida
foram novamente agitados no vórtex durante 15 segundos. Os tubos foram levados ao banho-
maria fervente por 15 minutos e depois resfriados em gelo para então serem centrifugados a
em espectrofotômetro em comprimento de onda de 532 nm. As determinações foram
realizadas em duplicata. Para a quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS), foi usado TEP (1,1,3,3 - tetraetoxipropano) para elaboração da curva padrão.
Foram utilizadas soluções contendo TCA/TBA/BHT e volumes de TEP de 0 a 250 µL com
intervalos de 50 µL entre eles. Os resultados foram expressos em nmol de malondialdeído
(MDA)/mg de proteína .
3.14.4 Carbonilação de proteínas
Os danos oxidativos em proteínas foram avaliados em homogeneizados cerebrais
através da determinação de grupo carbonil, baseado na reação com 2,4-dinitrofenilhidrazina
(DNPH) descrita por Levine e colaboradores (LEVINE et al., 1994). Primeiramente, em dois
tubos de plástico de 1,5 mL foram adicionados os homogeneizados cerebrais. No tubo A foi
pipetado 0,5 mL de uma solução de 10 mM DNPH em HCl 2 M. No tubo B foi pipetado 0,5
mL de uma solução 2 M HCl. Os dois tubos foram incubados a 37 ºC por 90 minutos. Após
essa etapa foi adicionado 0,5 mL de ácido tricloroacético 28% em cada tubo e agitou-se por 3
minutos. Os tubos foram então centrifugados por 3 minutos a 6.000 x g e tiveram seu
sobrenadante descartado. O precipitado foi ressuspendido em 0,5 mL de uma solução 1:1 de
etanol e acetato etílico e centrifugado novamente por 6 minutos a 6.000 x g. O sobrenadante
foi novamente descartado e o precipitado foi finalmente ressuspendido em 0,5 mL de uma
solução 6 M hidrocloreto de guanidina. Os tubos foram centrifugados uma última vez a 6.000
x g por 3 minutos. Foi lida então a absorbância na faixa de 360 nm utilizando o tubo B como
branco, e a concentração de carbonila foi determinada usando um coeficiente de absorção
3.14.5 Complexos Mitocondriais
NADH desidrogenase (complexo I) contém flavina mononucleotídeo (FMN) e centros
ferro-enxofre (Fe-S). FMN recebe elétrons do NADH e é capaz de transferi-los aos centros
Fe-S. Quando o NADH é reoxidado a NAD+ a atividade deste complexo é avaliada pela taxa
de redução NADH dependente de ferricianeto em 420 nm, descrito por Cassina e Radi
(CASSINA; RADI, 1996).
No complexo II, o FAD recebe 2 elétrons e é reduzido a FADH2. Este transfere seus
elétrons para os centros Fe-S da succinato desidrogenase (SDH), que então doa esses elétrons
para a coenzima Q (CoQ), para que estes fluam pela cadeia respiratória. A atividade do
complexo II foi medida pela diminuição da absorbância causada pela redução do 2,6-
dicloroindofenol (DCIP) a 600 nm (FISCHER et al., 1985). O meio de incubação foi
constituído de fosfato de potássio (40 mM pH 7,4), succinato de sódio (16 mM) e DCIP (8
µM). Inicialmente pré-incubou-se com o homogeneizado a 30 °C por 20 minutos. Depois,
foram adicionados ao meio 4 mM de azida sódica e 7 µM de rotenona e a reação foi iniciada
pela adição de 40 µM de DCIP. As absorbâncias foram registradas por 5 minutos a 600 nm.
No complexo III, os elétrons fluem entre os citocromos no sentido do citocromo de
menor potencial redox para o de maior. Os átomos de ferro nos citocromos que se encontram
no estado Fe+3 recebem um elétron e são reduzidos para Fe+2 , e, ao passar este elétron para o
próximo componente da cadeia respiratória, o ferro é reoxidado a Fe+3. Atividade do
complexo II-III foi medida pela redução citocromo c a 550 nm (FISCHER et al., 1985). O
meio de reação, constituído de fosfato de potássio (40 mM pH 7,4), de succinato de sódio (16
mM), foi pré-incubado com 40-80 µg de proteínas do homogeneizado a 30 °C por 30 minutos.
Em seguida, foram adicionados 4 mM de azida sódica e 7 µM de rotenona e a reação foi
iniciada pela adição de 0,6 µg/mL de citocromo c e as absorbâncias foram registradas por 5
A citocromo oxidase ou complexo IV, último complexo da cadeia respiratória,
transfere elétrons do citocromo c para o O2. Este complexo contém os citocromos a e a3 e um
sítio de ligação ao O2. Cada molécula de O2 precisa receber 4 elétrons para ser reduzida a 2
H2O. Neste complexo, a presença de íons Cu+2 facilita a redução do O2. A atividade da
citocromo c oxidase foi analisada de acordo com o método descrito por Rustin e
colaboradores medido pela diminuição da absorbância devido à oxidação do citocromo c
anteriormente reduzido em 550 nm (RUSTIN et al., 1991). O meio de incubação continha
tampão fosfato de potássio (10 mM, pH 7,0), lauril maltósito (0,6 mM) e 10-20 µg de
proteínas (homogeneizado). A reação foi iniciada com a adição de 0,7 µg de citocromo c
reduzido. A atividade do complexo IV foi medida a 25 °C por 10 minutos.
A atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial foram calculados em
nmol.minutos−1.mg de proteina−1.
3.14.6 Succinato desidrogenase
A atividade de succinato desidrogenase foi determinada de acordo com o método de
Fischer e colaboradores (FISCHER et al., 1985). A reação baseia-se na diminuição da
absorbância devido à redução do 2,6 - diclorofenol-indofenol (2,6-DCIP) a 600 nm, sendo que
o comprimento de onda a 700 nm é usado como referência (ɛ = 19,1 mM-1 cm-1) na presença
de metilsulfato de fenazina (PMS). A mistura de reação consistindo de fosfato de potássio 40
mM (pH 7,4), 16 mM de succinato e 8 µM 2,6-DCIP foi pré-incubada com a proteína de
homogeneizados cerebrais a 30 ° C durante 20 minutos. Subsequentemente, 4 mM de azida de
sódio, 7 µM rotenona e 40 µM 2,6-DCIP foram adicionados e a reacção foi iniciada pela
adição de 1 mM PMS e foi monitorizada durante 5 minutos. A atividade foi calculada em
3.14.7 Creatina quinase (CK)
A atividade da creatina quinase (CK) foi avaliada em homogeneizados cerebrais pré-
tratados com lauril maltosídeo 0,625 mM segundo o método de Hughes (HUGHES, 1962).
Resumidamente, a reação consistiu numa mistura contendo Tris-HCl 60 mM, pH 7,5,
fosfocreatina 7,0 mM, MgSO4 9,0 mM e cerca de 0,4-1,2 mg de proteína em um volume final
de 100 µL. Após um período de 15 minutos de pré-incubação, a reação foi iniciada com a
adição de ADP a uma concentração final de 3,2 mM em 100 µL de meio contendo 7,08 mM
de fosfocreatina, 0,8 mM de glutationa e de 0,8 a 1 µg de proteínas (homogeneizado). Após
um período de 10 minutos de incubação, a reação foi interrompida com 20 µL de ácido p-
hidroximercuribenzóico (pHMB) 50 mM e a coloração rósea foi obtida pela adição de 100 µL
de α-naftol 20%, 680 µL de água MilliQ e 100 µL de diacetil 20%. A leitura foi feita por
espectrometria a 540 nm. Para calcular a atividade da CK nas amostras, foi feita uma curva de
calibração com creatina nas concentrações de 4 nmol/mL (60 µL de fosfocreatina, 10 µL de
creatina-padrão e 10 µL de água MilliQ) e 8 nmol/mL (60 µL de fosfocreatina e 20µL de
creatina-padrão). Daí obteve-se o fator de calibração médio (FCM) necessário para os
cálculos de atividade da CK. Os resultados foram expressos em unidades / mg de proteína.