Mill’in İnsan ve Değer Anlayışı

PELA SERCA NÃO É O FATOR LIMITANTE PARA A RESTITUIÇÃO DA

AMPLITUDE DO TRANSIENTE CITOSÓLICO DE Ca2+ _{À TEMPERATURA FISIOLÓGICA}

Diversos trabalhos vêm mostrando que após uma CICR há uma depleção parcial dos estoques de Ca2+ _{no jRS (BROCHET et al., 2005, LAVER et al., 2013) e muitos outros trabalhos}

citam que a amplitude da CICR seguinte é determinada, pelo menos em parte, pela velocidade com que a SERCA recapta para o lúmen do retículo o Ca2+ _{liberado. Curiosamente, poucos}

estudos buscaram testar essa hipótese e aqueles que tentaram (SZENTESI et al., 2004), obtiveram seus dados à uma frequência de estimulação muito baixa, à temperatura ambiente e também manipulando intensamente o meio intracelular. É sabido que a atividade da SERCA é sensível à frequência cardíaca, à concentração de determinados íons intracelulares e também à temperatura (Q10 próximo de 3) (Bers, 2001). Para testar se a recaptação pela SERCA é um fator limitante para a refratariedade do transiente de Ca2+ _{em condições mais próximas à}

fisiológica, foram obtidas curvas de restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+_{, em}

células sob estimulação de campo, antes e após a exposição à 60 nM de tapsigargina (por 3 minutos), um inibidor seletivo e irreversível da SERCA. Caso 60 nM de tapsigargina seja suficiente para bloquear parcialmente a SERCA, a mesma deve induzir pelo menos três tipos de efeitos no manejo intracelular de Ca2+_{, a saber: 1) redução da amplitude do transiente de}

Ca2+ _{medido após a exposição à tapsigargina, uma vez que com a redução da atividade da}

SERCA espera-se uma menor carga de Ca2+ _{no RS a cada ciclo cardíaco, 2) aumento no tempo}

necessário para que 90 % do decaimento do pico do transiente (t90) seja alcançado e 3)

redução na carga total de Ca2+ _{no RS. A figura 28 mostra os traçados representativos obtidos}

por microscopia confocal e seus respectivos valores de F/F0. Nela pode ser observado que a

exposição à tapsigargina foi capaz de aumentar o valor de t90 de 178,9 ± 14,4 para 208 ± 18

(n=8, p < 0,05) e de reduzir o pico do transiente de Ca2+ _{de 3,3 ± 0,27 para 2,75 ± 0,2 (n = 7, p <}

0,05), tal como esperado no caso de um bloqueio parcial da SERCA. A figura 29A (painel superior) mostra a INCX evocada após maciça liberação de Ca2+ pelo RS, em resposta à rápida

exposição da célula à 10 mM de cafeína. O painel inferior dessa mesma figura ilustra os valores de conteúdo total de Ca2+ _{do RS estimados após integração da área delimitada pela curva da}

INCX na ausência (68,8 mol.L-1) e na presença (60,1 mol.L-1) de 60 nM de tapsigargina, uma

redução de 12,8 %. A figura 29B mostra ainda que 60 nM de tapsigargina reduz, em média, 19,6 ± 7,1% do conteúdo total de Ca2+ _{no RS (n=3, p < 0,05). Tais dados sugerem fortemente}

que a tapsigargina, nessa concentração, estava bloqueando parcialmente a SERCA nas condições experimentais desse trabalho.

Figura 28. Efeito de 60 nM de tapsigargina nos parâmetros do transiente citosólico de Ca2+_{. A)}

Traçados experimentais obtidos antes (painel esquerdo) e depois (painel direito) da exposição à 60 nM de tapsigargina (por 3 minutos). B) Sobreposição dos traçados de transientes de Ca2+

normalizados na ausência (em preto) e na presença (em vermelho) de tapsigargina. C) Valores médios do t90 na situação controle e na presença de tapsigarnina (n = 8, * p < 0,05) e D) Valores

médios do pico do transiente de Ca2+ _{na situação controle e na presença de tapsigarnina (n = 7,}

Figura 29. Efeito de 60 nM de tapsigargina sobre a carga total de Ca2+ _{do RS. A) Painel}

superior mostra traçados representativos da INCX induzida pela rápida aplicação de 10 mM de

cafeína na situação controle, após 3 minutos de exposição a 60 nM de tapsigargina e a sobreposição dos dois traçados. O painel inferior mostra as correntes integradas e convertidas em µmol/L de citosol. B) Redução média da carga total de Ca2+ _{do RS após exposição dos}

cardiomiócitos a 60 nM tapsigargina (36 ± 1 o_{C, n = 3, * p < 0,05).}

Após atestar que 60 nM de tapsigargina estava de fato inibindo parcialmente a SERCA, foi então investigado o efeito dessa substância no curso temporal da restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+_{. Caso a recaptação da SERCA seja um fator limitante para a}

refratariedade do transiente citosólico de Ca2+ _{em condições fisiológicas, dever-se-ia observar}

um claro desvio da curva de restituição da amplitude do transiente de Ca2+ _{para a direita com a}

inibição dessa proteína transportadora. A figura 30A mostra os traçados dos transientes de Ca2+

obtidos de um cardiomiócito na ausência (painel esquerdo) e na presença de 60 nM de tapsigargina (painel direito). Como pode ser visto nessa figura, é muito difícil notar qualquer tipo de deslocamento. A figura 30B ilustra com mais clareza que a inibição da SERCA não modifica o curso temporal da restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+_{, uma vez que não}

presença (146,8 ± 9,4 ms; n = 8; p < 0,05) dessa droga. Com isso, pode-se sugerir que a recaptação de Ca2+ _{pela SERCA não é um passo relevante para o controle desse evento}

celular.

Figura 30. Efeito da tapsigargina sobre o curso temporal da restituição da amplitude do

transiente citosólico de Ca2+ _{em cardiomiócitos ventriculares. A) Traçados normalizados e}

sobrepostos mostrando restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ _{com o aumento}

do intervalo entre os pulsos na ausência (esquerda) e na presença (direita) de 60 nM de tapsigargina. B) Curva de restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ _{na ausência}

(linha preta) e na presença (linha vermelha) de 60 nM de tapsigargina (36 ± 1 o_{C, n = 8).}

Para reforçar a hipótese levantada com base nos experimentos com o uso da tapsigargina, foi usada uma outra ferramenta farmacológica, o ácido ciclopiazônico (CPA), cuja ação é também a de inibir a SERCA. A figura 31A mostra os traçados representativos dos transientes de Ca2+ _{obtidos em uma célula na situação controle (painel esquerdo) e após 3}

minutos de exposição a 2 M de CPA. O CPA (2 M) foi capaz de reduzir o pico do transiente citosólico de Ca2+ _{de 3,4 ± 0,2 para 2,7 ± 0,1 (figura 31D, n=9, p < 0,05) (figura 31C). Também}

foi observado que a exposição ao CPA aumentou o tempo para decaimento do transiente (figuras 31B e C), alterando o t90 de 150 ± 9 ms para 180 ± 10 ms (n= 9, p < 0,05). Esses dados

sugerem que a concentração de CPA aqui escolhida foi capaz de inibir parcialmente a SERCA. Todavia, de modo semelhante aos experimentos usando-se a tapsigargina, nenhum desvio estatisticamente significativo foi observado na curva de restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ _{na presença de CPA, tal como pode ser ilustrado na figura 32 (n = 8, p >}

0,05). Desta maneira, o conjunto de evidências levantadas indicam que a recaptação do Ca2+

pela SERCA não governa a refratariedade da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ _em

condições fisiológicas. Essa conclusão encoraja levantar a hipótese de que, após uma CICR, a depleção dos estoques de Ca2+ _{seja restrita ao lúmen do jRS, de tal modo que o montante de}

Ca2+ _{no njRS permaneceria grande o suficiente para suprir a demanda fisiológica celular para}

CICR seguinte. Sendo assim, mudanças na velocidade de recaptação de Ca2+ _pouco

influenciariam no suprimento de Ca2+ _{para o jRS pois teoricamente a SERCA não interfere na}

velocidade de difusão de Ca2+ _{entre o njRS e o jRS.}

Figura 31. Efeito de 2 M de CPA nos parâmetros do transiente citosólico de Ca2+_{. A) Traçados}

experimentais obtidos antes (painel esquerdo) e depois (painel direito) da exposição de CPA (2 M por 2 a 4 minutos). B) Sobreposição dos traçados de transientes normalizados na ausência

(preto) e na presença (vermelho) de CPA. C) Valores médios do t90 na situação controle e na

presença de CPA (n = 9, * p < 0,05) e D) Valores médios do pico do transiente citosólico de Ca2+ _{na situação controle e na presença de CPA (n = 9, * p < 0,05). Frequência de estimulação}

de 2Hz (39V, 2 ms). Temperatura = 36 ± 1 o_C.

Figura 32. Efeito de 2 µM de CPA sobre a restituição da amplitude do transiente de Ca2+ _em

cardiomiócitos ventriculares. A) Traçados normalizados mostrando a restituição da amplitude do transiente de Ca2+ _{com o aumento do intervalo entre os pulsos na ausência (esquerda) e na}

presença (direita) de 2 M de CPA. B) Curva de restituição da amplitude do transiente de Ca2+

na ausência (curva preta) e na presença (curva vermelha) de 2 M de CPA (n = 8, 36 ± 1 o_C).