Havuçlara Uygulanan Kimyasal Analizler

Havuçların katı meyve sıkacağı ile suyu çıkartılıp saf suya göre kalibre edilmiş el refraktometresi 0-53 ölçekli, Pocket Refractometer PAL-1 üzerine alınıp okumalar yapılmıştır ve sonuçlar “%” olarak ifade edilmiştir.

Araziden getirilip yıkanan ve -80°C’ de depolanan havuçlar blenderdan geçirilmek suretiyle püre haline getirilerek 6 gr olarak tüplere alınan örneklere 15 ml Metanol-HCl çözeltisinden eklendi. (Şekil.3.7) ve 24 saat karanlıkta buzdolabında bekletildi. 24 saat sonunda fitokimyasal özelliklerine bakıldı.

Şekil 3.7. Havuçların fenolik ekstraksiyonu a solüsyonundaki inkübasyonu 3.2.1.2. Toplam Fenolik Maddeler Tayini Örnekler 24 saat boyun

ve saf su 1:1:20 oranlarında ilave edilerek 8 dakika bekletilmi

lik sodyum karbonat ilave edilip 2 saat inkübasyondan sonra mavimsi bir renk alan çözeltinin absorbansı spektrofotometrede 750

3.8). Standart olarak gallik asit kullanılmı

faydalanılarak örneklerin fenolik madde miktarı gallik asit e ya da mg/kg olarak hesaplan

Şekil 3.8. Spektrofotometrede 750 nm dalga boyunda ölçülen örnekler Havuçların fenolik ekstraksiyonu aşamasında örneklerin Metanol solüsyonundaki inkübasyonu

Toplam Fenolik Maddeler Tayini

boyunca inkübe edildikten sonra üzerine, folin-ciocalteu’s kimyasalı oranlarında ilave edilerek 8 dakika bekletilmiştir. Sonra 2,5 mL lik sodyum karbonat ilave edilip 2 saat inkübasyondan sonra mavimsi bir renk alan

absorbansı spektrofotometrede 750 nm dalga boyunda ölçülmü

Standart olarak gallik asit kullanılmıştır. Standartlarla hazırlanan grafikten faydalanılarak örneklerin fenolik madde miktarı gallik asit eşdeğeri (

ya da mg/kg olarak hesaplanmıştır (Singleton ve Rossi, 1965).

Spektrofotometrede 750 nm dalga boyunda ölçülen örnekler Metanol-HCl

ciocalteu’s kimyasalı ştir. Sonra 2,5 mL %7’ lik sodyum karbonat ilave edilip 2 saat inkübasyondan sonra mavimsi bir renk alan yunda ölçülmüştür (Şekil tır. Standartlarla hazırlanan grafikten ğeri (µg GAE/g örnek)

3.2.1.3. Demir İndirgenme Antioksidan Kapasitesi Analizi (FRAP)

Analiz için (Benzie ve Strain, 1996)’a göre 0,1 mol/L asetat (pH 3.6), 10 µmol/L TPTZ, ve 20 µmol/L demir klorid çözeltileri (10:1:1) oranlarında karıştırılarak tampon çözelti hazırlanmıştır. Son olarak 0,25 mL ekstrakta 2.97 ml hazırlanan tampon çözelti ilave edilerek karıştırılmıştır (Şekil 3.9) ve 30 dakika sonra spektrofotometrede 593 nm dalga boyunda absorbansı ölçülmüştür. Elde edilen absorbans değerleri Trolox (10–100 µmol/L) standart eğim çizelgesi ile hesaplanarak µmol Troloks eşdeğeri/g yaş ağırlık olarak belirtilmiştir.

Şekil.3.9. Örneklere tampon çözelti ilave edilmesi

3.2.1.4. Troloks Eşdeğer Antioksidan Kapasitesi Analizi (TEAC)

Analiz için 7 mM ABTS (2,2’-Azino-bis 3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 2,45 mM potasyumbisülfat ile karıştırılarak karanlık ortamda 12-16 saat bekletilmiştir. Daha sonra bu solüsyon 20 mM sodyum asetat (pH 4.5) bafırı ile spektrofotometrede 734 nm dalga boyunda 0,700±0,01 absorbans olacak şekilde sadeleştirilmiştir. Nihayetinde 30 µL ekstrakt ve 2.97 mL hazırlanan bafır karıştırılarak absorbans 10 dakika sonra spektrofotometrede 734 nm dalga boyunda ölçülmüştür (Şekil 3.10). Elde edilen absorbans değerleri Trolox (10–100 µmol/L) standart eğim çizelgesi ile hesaplanarak µmol Troloks eşdeğeri/g yaş ağırlık olarak belirlenmiştir.

3.2.1.5. β-Karoten Analizi

Blenderdan geçirilen havuçlar liyafilizator de -800C de suyu uçurulmak suretiyle kurutulmuştur. De Ritter and Purcell (1981)’den modifiye edilen yönteme göre

kurutulan örneklerden

hazırlanan solüsyondan ilave edilip 2 ortamda 45 dk bekletilmi

örnekler spektrofotometrede 450 ölçülmüştür. Standartlarla

faydalanılarak örneklerin karotenoid miktarı (Şekil 3.11).

Şekil 3.11. Karotenoid içeri

3.2.1.6. Şeker (glikoz, fruktoz, sakkar

Blender da öğütülen havuç pulpuna 10000d/d uygulanmıştır. Üstte kalan berrak kısım alınarak analize hazır hale getirilmi

ve ark., (1995)’ten modifiye edilerek

3.12). Glikoz, fruktoz ve sakkaroz miktarı daha önce hazırlanmı hesaplanmış ve miktarlar g/100g cinsinden belirtilmi

Akış hızı: 0,9 mL

Mobil faz: % 80 asetonitril + % 20 deionize su Sıcaklık: 30

Süre: 30 dakika

Kolon: SS Exsil Amino, SGE (250x4,6 mm ) Dedektör: RI, Perkin Elmer (series

kurutulan örneklerden 0,02 gr alınıp 10 ml 2:1:1 oranında (hekzan:aseton:etanol) hazırlanan solüsyondan ilave edilip 2 dk homojenizatörden geçirililmi

ortamda 45 dk bekletilmişlerdir. İnkübasyon sonunda üst kısımdaki sıv

fotometrede 450 nm dalga boyunda cam küvetlere koyularak absorbansı Standartlarla (β-karoten, Sigma-Aldrich) hazırlanan grafikten aydalanılarak örneklerin karotenoid miktarı µg β-karoten /g KA olarak hesaplan

Karotenoid içeriğinin belirlenmesi

koz, fruktoz, sakkaroz) Kompozisyonunun Belirlenmesi ütülen havuç pulpuna 10000d/da 10 dakika santifürüj

tte kalan berrak kısım alınarak 0,45 µm’lik membran filtreden analize hazır hale getirilmiştir. Yüksek basınç sıvı kromotografisinde analiz

modifiye edilerek aşağıda verildiği şekilde uygulanmı

koz, fruktoz ve sakkaroz miktarı daha önce hazırlanmış olan standart grafikten ve miktarlar g/100g cinsinden belirtilmiştir.

0,9 mL/dak

% 80 asetonitril + % 20 deionize su 30 oC

30 dakika

SS Exsil Amino, SGE (250x4,6 mm ) - USA RI, Perkin Elmer (series-200) - Japan

gr alınıp 10 ml 2:1:1 oranında (hekzan:aseton:etanol) nizatörden geçirililmiş ve karanlık bir basyon sonunda üst kısımdaki sıvı fazdan alınan oyunda cam küvetlere koyularak absorbansı hazırlanan grafikten olarak hesaplanmıştır

irlenmesi

a 10 dakika santifürüj işlemi 0,45 µm’lik membran filtreden süzülüp tir. Yüksek basınç sıvı kromotografisinde analiz; Bartolome lde uygulanmıştır (Şekil ş olan standart grafikten

Şekil 3.12. Kromotografik analizler için HPLC’ye enjeksiyon

3.2.1.7. Organik asit (malik, askorbik, sitrik) Kompozisyonunun Belirlenmesi Homojenizatörde pulp haline getirilen meyveden 5 g alınıp üzerine 20 mL deionize su ilave edilip 3 dakika homojenize edilmiştir. Daha sonra 0,45 µm’lik membran filtreden geçirilip analize hazır hale getirilmiştir. Yüksek basınç sıvı kromotografide (HPLC) analiz için Shui ve Leong, (2002)’den değiştirilerek; mobil faz A; 2,5 pH’a ayarlanıp sülfürik asit çözeltisi, mobil faz B; metanol, analiz süresi (başlangıç koşulları 0,5 mL/dk akış hızında %100 mobil faz A, 15 dakika 0,5ml/dakika akış hızında %100 mobil faz A, 5 dakika 0,54 mL/dakika akış hızında %95 A+ % 5 B, 5 dakika 0,3 mL/dakika akış hızında %100 B) 25 dakika ve kolon sıcaklığı 300C olarak uygulanmıştır. Analizde SGE (250x4.6mm SS WAKOSIL C18RS 5µm OmniSpher) HPLC kolon kullanılmıştır. Sitrik, malik, askorbik asit miktarı Perkin Elmer (series-200) U/V dedektörde 215 nm dalga boyu kullanılarak alıkonma zamanına göre tespit edilip pik alanına göre daha önce hazırlanan standart grafikten hesaplanıp ve miktarlar g/100g olarak verilmiştir.

3.2.2. İstatiksel Değerlendirme

Deneme tesadüf blokları deneme desenine göre 3 tekerrürlü olarak kurulmuştur. Toplanan veriler varyans analizi ile analiz edildikten sonra, uygulama ortalamaları arasındaki önem düzeyi Duncan çoklu karşılaştırma testi ile belirlenmiştir.

4. BULGULAR ve TARTIŞMA