İn Vitro Hücre Kültürü Çalışmaları

İn vitro hücre kültürü çalışmaları literatürde folat reseptör düzeyi normal (A549) (234) ve yüksek (H1299) (235) olarak belirtilen insan ve in vivo çalışmalarda kullanılan Lewis Lung Carcinoma (LLC-1) fare KHDAK hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Kullanılan 3 hücre hattı da adheren özelliktedir.

A549 hücreleri %1 Penisilin-Streptomisin, %1 Glutamin ve %10 Fetalbovin serum içeren yüksek glukozlu DMEM besiyerinde; H1299 ve LLC-1 hücreleri ise %1 Penisilin-Streptomisin, %1 Glutamin ve %10 Fetalbovin serum içeren RPMI besiyerinde büyütülmüştür.

3.12.1. Folat Reseptör Tayini

A549 ve H1299 KHDAK hücrelerinin folat reseptör düzeyleri akım sitometri ile tespit edilmiştir. Folat reseptör-1 (FOLR-1) yüzey belirteci özgül monoklonal antikorlar ile doğrudan işaretleme sonrasında akım sitometri cihazı ile ve FACSDiva bilgisayar yazılımı kullanılarak 3 kez yapılmıştır.

Bu amaçla 2 hücre hattı, hücre kazıma yöntemi ile kaldırılmış ve toplamda 6 örnek üzerinde akım sitometri analizi çalışmaları yapılmıştır. Her bir örnek için 2 flow tüpü hazırlanmış, bunlardan biri FOLR-1 yüzey belirteci özgül monoklonal antikor ile diğeri izotipik kontrol antikoru ile doğrudan işaretlenmiştir. İşaretleme sonrası, FACSAria-II akım sitometri cihazı ile ve FACSDiva bilgisayar yazılımı kullanılarak reseptör miktarı araştırılmıştır.

3.12.2. Rodaminle Konjuge Lipozom Formülasyonlarının Tümör Hücreleri Tarafından Tutulumunun İn Vitro İncelenmesi Lipozom Formülasyonlarının Rodamin ile Konjugasyonu

Rodaminle konjuge (Rodamin işaretli) pasif ve Folat ile aktif hedefli lipozom formülasyonları, sırasıyla bölüm 3.7.5. ve bölüm 3.7.10’da anlatıldığı şekilde hazırlanmıştır.

Akım Sitometri Analizi

Rodaminle konjuge pasif hedeflendirilmiş lipozom, Rodaminle konjuge yüzeyi folat ile modifiye edilmiş aktif hedeflendirilmiş lipozom ve kontrol grubu olarak Rodamin işaretli olmayan lipozom formülasyonları PBS içinde seyreltilerek, 12 kuyucuklu plaklara 1 mM (n=3) konsantrasyonda 1 gün önce ekilmiş A549, H1299 ve LLC-1 hücre hatlarının üzerine eklenmiştir. Hücreler 2, 4 ve 6 saat 37^oC’de inkübatörde bekletildikten sonra üzerlerindeki besiyerleri uzaklaştırılıp, A549 ve H1299 hücreleri 100 µL Tripsin EDTA ile, LLC-1 hücreleri ise plaklara vurma suretiyle kaldırılmıştır. Ardından, 500 µL besiyeri Tripsinlenen örneklere eklenmiş, örnekler 1800 rpm’de 5 dk santrifüj edilip üzerindeki süpernatant atılmış, ardından serum fizyolojik ile süspande edilen hücreler akım sitometri cihazında FACSDiva yazılımı kullanılarak okunmuştur.

Tümör Hücresi Tutulumlarının Floresans Mikroskobu ile Görüntülenmesi Rodaminle konjuge pasif hedefli ve Rodaminle konjuge folatla aktif hedefli antikanser ilaç içermeyen lipozom formülasyonları PBS içinde seyreltilerek, 12 kuyucuklu plaklara 1 µM konsantrasyonda bir gün önce ekilmiş A549, H1299 ve

LLC-1 hücre hatlarının üzerine eklenmiş ve LLC-1 ile 2 saatlik inkübasyonlara bırakılmıştır.

İnkübasyon süresinin sonunda besiyerleri atılıp, kuyular PBS ile 3 kez yıkanmış, ardından %4’lük formaldehit çözeltisi ile 15 dk fikse edilmiştir. Fikse edilen hücreler üzerindeki formaldehit çözeltisi uzaklaştırılmış, hücreler tekrar PBS ile yıkanmış, üzerlerine 1/1000 oranında seyreltilmiş 1.5 mL Triton X-100 eklenip 3 dk beklendikten sonra tekrar PBS ile yıkanmıştır. Hücreleri boyamak için 750 nM konsantrasyondaki 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisinden 700 µl eklenmiş ve 30 dk inkübasyon sonunda 3 kez PBS ile yıkanarak floresans mikroskobu altında incelenmiştir.

3.12.3. ^99mTc ile İşaretli Lipozom Formülasyonlarının Tümör Hücreleri Tarafından Tutulumunun İn Vitro İncelenmesi

Bölüm 3.11’de anlatıldığı şekilde ^99mTc ile işaretlenen aktif veya pasif hedefli antikanser ilaç içermeyen lipozom formülasyonları PBS içinde seyreltilerek, 12 kuyucuklu plaklara 1 mM (n=3) konsantrasyonda bir gün önce ekilmiş A549, H1299 ve LLC-1 hücre hatlarının üzerine eklenmiştir. 4 saatlik inkübasyon süresi sonunda bağlanmayan lipozom formülasyonlarını uzaklaştırmak için hücreler PBS ile 3 kez yıkanmıştır. Ardından A549 ve H1299 tripsinizasyon, LLC-1 hücreleri el ile vurularak kaldırılmış, toplam hacim 1 mL olacak şekilde kuyulara uygun besiyerleri ilave edilmiştir. Radyoaktif işaretli lipozomların tümör hücre tutulumları gama sayacı ile saptanmıştır.

Deney gruplarının yanı sıra radyoaktivitenin dilüsyonu ve zaman sebebiyle azalması gibi faktörler göz önüne alınarak, kontrol numunesi hazırlanmıştır. Kontrol numunesi için, hücrelere eklenen aynı miktar ^99mTc işaretli lipozom 1 mL besiyeri içinde süspande edilmiş ve bu çözeltinin aktivitesi okunmuştur.

Lipozom formülasyonlarının A549, H1299 ve LLC-1 hücreleri tarafından % tutulumları Eşitlik 3.2.’de verilen formüle göre hesaplanmıştır:

% 𝑇𝑢𝑡𝑢𝑙𝑢𝑚 =

𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑔𝑟𝑢𝑏𝑢𝑛𝑢𝑛 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑠𝑖

(3.2.)

3.12.4. Lipozom Formülasyonlarının İn Vitro Hücre Canlılığına Etkisinin İncelenmesi

A549 ve H1299 Hücre Hatlarındaki Canlılığın MTT Analizi ile Saptanması

Uygun çözünürlük özelliklerine göre Cremephor içerisindeki serbest PCX ve distile su içerisindeki serbest VNB, serbest PCX + VNB çözeltisi, antikanser ilaç içermeyen aktif veya pasif hedefli lipozom formülasyonları ve tek ilaç (PCX veya VNB) içeren folat ile aktif ve/veya pasif hedefli olan, kombine ilaç (PCX+ VNB) içeren folat ile aktif veya pasif hedefli olan lipozom formülasyonlarının A549 ve H1299 hücre hatları üzerindeki sitotoksik aktivite göstebileceği en düşük dozu bulmak amacıyla, farklı konsantrasyonlarda hazırlanan ilaç çözeltileri hücre hatlarına uygulanarak sitotoksisite elde edilebilecek uygun ilaç dozları (Inhibition concentration 50 (IC50 değeri)) hesaplanmıştır. Sitotoksisite MTT testi ile yapılmıştır.

Bunun için, kanser hücreleri besi yeri içinde (50 μl hacimde) 96 kuyucuklu plaklara ilaç uygulanmasından 1 gece önce ekilmiş, hücrelerin üzerine farklı konsantrasyonlarda Cremephor içerisindeki serbest PCX ve distile su içerisindeki serbest VNB, serbest PCX + VNB çözeltisi, antikanser ilaç içermeyen pasif hedefli lipozom formülasyonları ve tek ilaç (PCX veya VNB) içeren pasif hedefli olan lipozom formülasyonları, kombine ilaç (PCX+ VNB) içeren pasif hedefli olan lipozom formülasyonları (50 μl hacimde) ilave edilmiştir. 48 saat boyunca %5 CO2’li inkübatörde kültürleri gerçekleştirildikten sonra sitotoksik etki kantitatif olarak ölçülmüştür. Bu amaçla, hücrelerin üzerine 25 μl MTT eklenerek 4 saat inkübe edilmiş, inkübasyon sonrası kuyulara 80 μl %45’lik dimetilformamid (DMF) içinde çözülmüş %23 sodyumdodesilsulfat çözeltisi (SDS) (pH 4.7) eklenerek plaklar bir gece etüvde bırakılmıştır. 12-15 saat sonra spektrofotometrik olarak 570 nm’de ekstraksiyon tamponu olan SDS-DMF çözeltisine karşı absorbans değerleri okunmuştur.

Yapılan ön deneme sonucunda folat ile aktif hedefli lipozom formülasyonlarının (antikanser ilaç içermeyen aktif hedefli lipozom formülasyonları ve tek ilaç (PCX veya VNB) içeren folat ile aktif hedefli olan, kombine ilaç (PCX+

VNB) içeren folat ile aktif hedefli olan lipozom formülasyonları) MTT çözeltisi ile etkileşime girdiği saptanmıştır. Bu lipozom formülasyonlarının hücreler ile 48 saat’lik

inkübasyonları sonunda kuyucuklara MTT eklenmeden önce kuyucuklardaki lipozom formülasyonları uzaklaştırılıp, kuyucuklar PBS ile yıkanıp hücrelerin üzerine taze besiyerleri eklenmiştir. Sonrasında hücrelerin üzerine 25 μl MTT eklenerek 4 saat inkübe edilmiş, inkübasyon sonrası kuyulara 80 μl %45’lik DMF içinde çözülmüş %23 SDS (pH 4.7) eklenerek plaklar bir gece etüvde bırakılmıştır. 12-15 saat sonra spektrofotometrik olarak 570 nm’de ekstraksiyon tamponu olan SDS-DMF çözeltisine karşı absorbans değerleri okunmuştur.

LLC-1 Hücre Canlılığının Akım Sitometri ile Değerlendirilmesi

Serbest PCX çözeltisi, serbest VNB çözeltisi, serbest PCX + VNB çözeltisi, antikanser ilaç içermeyen aktif veya pasif hedefli lipozom formülasyonları ve tek ilaç (PCX veya VNB) içeren folat ile aktif veya pasif hedefli olan lipozom formülasyonları, kombine ilaç (PCX+ VNB) içeren folat ile aktif veya pasif hedefli olan lipozom formülasyonlarının LLC-1 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri Propidyum iyodür (PI) boyası ile boyanan ölü hücrelerin akım sitometride analizi ile değerlendirilmiştir.

Bu amaçla serbest ilaçlar ve tüm lipozom formülasyonları 1 gün önceden 12 kuyucuklu plaklara ekilmiş LLC-1 hücrelerinin üzerine PBS ile seyreltilerek farklı konsantrasyonlarda eklenmiş ve 48 saat boyunca, 37^oC’de %5 CO2’li inkübatörde inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda hücreler 100 µL CellWash™

içinde resuspende edilmiş ve bu süspansiyon üzerine final konsantrasyon 25 ng.mL^-1 olacak şekilde 5 µL PI boyası eklenmiştir. Karanlıkta, oda sıcaklığında 5 dk bekletilen hücreler, 1 mL CellWash™ ile yıkanmış ve 1800 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir.

Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, hücreler 150 µL CellWash™ içinde tekrar süspande edilerek akım sitometride analiz edilmiştir.