Lipozom Formülasyonlarının İn Vitro Hücre Canlılığına Etkisinin İncelenmesi

Grafikten de anlaşıldığı üzere, 4 saatlik inkübasyon süresi sonunda 3 hücre hattı için de Lipo formülasyonu, Fol-Lipo formülasyonuna göre hücre membranında daha çok tutulmaktadır (p<0.05). Bu sonuç hücre membranındaki spesifik olmayan tutulumdan kaynaklı olup, Bölüm 4.10.2’de alınan akım sitometri sonuçları ve floresans mikroskop görüntüleri ile uyumludur.

Her iki formülasyon için de 4. saatte hücrelerdeki tutulumları, en yüksekten en düşüğe doğru LLC-1> H1299> A549 şeklinde sıralamak mümkündür (p<0.05).

Ayrıca literatüre (234, 235, 302) ve Bölüm 4.10.2’de verilen akım sitometri analizi sonuçları ile uyumlu olacak şekilde, folat ile aktif hedefli lipozom formülasyonlarının tutulumlarının LLC-1> H1299> A549 şeklinde olması, folat reseptör ekspresyon miktarı yüksek olan hücre hattından düşük olan hücre hattına göre sıralandığını göstermektedir.

Literatürde yapılan çalışmada (303) ^99mTc işaretli monoklonal antikor ile aktif hedefli lipozomların, aktif hedefli olmayan partiküllere göre hücrede daha yüksek oranda tutulduğu gösterilmiştir. Bu sonuç, bizim bulgularımızla ters gözükmektedir.

Ancak akım sitometri analiz sonuçları ve immunfloresans mikroskop görüntülerinde hazırlanan Lipo formülasyonunun hücrede folat reseptöründen bağımsız şekilde non-spesifik tutulması daha yüksek oranda radyoaktivite okunmasına sebep olmuştur. Fol-Lipo formülasyonu hücre içerisine folat reseptör aracılığıyla daha kontrollü şekilde girmektedir. Bu durum özellikle folat reseptörünün kanserli hücrelere göre daha az eksprese olduğu sağlıklı hücrelerde lipozomların kontrollü şekilde tutulmasına, böylece sitotoksik ilaçların gösterdiği yan etkinin azalmasına katkıda bulunacaktır.

5.5.4. Lipozom Formülasyonlarının İn Vitro Hücre Canlılığına Etkisinin

 hücre canlılığı,

 hücre metabolizması,

 erken apoptotik süreçte olan canlı hücrelerin varlığı

Tespit edilmekte olup, sitotoksisite değerlendirmesini akım sitometri kadar kesin şekilde yapamamaktadır. IC50 değeri, inhibe edici özelliği olduğu bilinen maddenin tam inhibisyonunu sağlayacak konsantrasyonun yarı eşdeğerini ifade etmektedir. Diğer bir deyişle, hücre canlılığında %50 azalmaya neden olan konsantrasyondur.

A549 ve H1299 hücre hatları üzerinde, MTT analizi yapılan tüm lipozom formülasyonları ve serbest ilaç çözeltilerine ilişkin sonuçlar sırasıyla Şekil 4.34 ve Şekil 4.35’de verilmiştir. Ayrıca yine MTT analizi ile tespit edilen serbest ve lipozomal ilaç moleküllerine ait IC50 değerleri Tablo 4.16 ve 4.17’de belirtilmiştir.

Tablo 4.16’da ve Tablo 4.17’de görülebileceği gibi serbest PCX ve VNB molekülünün IC50 değerlerinin lipozomal PCX ve VNB molekülünden istatistiksel açıdan anlamlı (p<0.05) biçimde düşük bulunması lipozomlardan ilaç salımının serbest ilaca göre daha yavaş ve kontrollü biçimde olduğunu kanıtlamakta olup, literatürle uyumludur (304, 305).

Folat ile aktif hedefli lipozomal PCX ve VNB’nin IC50 değerlerinin, pasif hedeflilere göre daha yüksek bulunması, Şekil 4.29’da gösterildiği gibi lipozomların non-spesifik hücre membranında veya içinde folat reseptöründen bağımsız şekilde tutulumunun daha yüksek olması ile ilişkili olup, uyum içerisindedir. Folat reseptörü ile hücre içine alımı, reseptör aracılı endositoz mekanizmasına dayanması sebebiyle daha kontrollü bir alımdır. Dolayısıyla folat ile aktif hedefli lipozomal PCX ve VNB’nin IC50 değerlerinin daha yüksek bulunması, lipozomların hücre içerisine folat reseptörü aracılığıyla daha kontrollü biçimde alındığını kanıtlamaktadır. Reseptör aracılı endositoz dışında hücre membranına internalize olan lipozom formülasyonları Şekil 5.1’de gösterilen mekanizmalarla ilaç salımına sebep olup, sitotoksik aktivite yaratabilmektedir (306). Folat ile aktif hedefli olmayan lipozom formülasyonları hücrede bu yolaklar üzerinden sitotoksik aktivite oluşturmaktadır.

Ayrıca kombine ilaç taşıyan lipozom formülasyonlarındaki PCX ve VNB’nin IC50 değerleri, yapıdaki ikinci ilaca bağlı olarak, tek ilaç taşıyan lipozomal PCX ve VNB’nin IC50 değerlerine göre anlamlı derecede (p<0.05) daha düşük olup, lipozomal

formülasyonlar arasındaki en yüksek sitotoksik aktiviteyi kombine ilaç taşıyan lipozomlarda görmek mümkündür.

Şekil 5.1. Lipozomların hücre içerisine reseptörden bağımsız non-spesifik alımı.

Endozom içerisindeki lipozomlar (1), lipozomların lizozom içinde parçalanması (2), endozom membranındaki destabilizasyon sebebiyle lipozomların etken maddeyi salması (3), endozom membranının lipozom membranı ile füzyonu sonucu etken maddenin salınması (4) (307).

Şekil 4.34 ve Şekil 4.35’te gösterilen şekilde, antikanser ilaç içermeyen akif hedefli ve aktif hedefli olmayan lipozom formülasyonlarının A549 ve H1299 hücreleri üzerinde sitotoksik etki göstermemiş olup, bu durum lipozom formülasyonlarının literatüre paralel şekilde (308) biyouyumlu olduğunu göstermektedir. Bu durum antikanser ilaç içermeyen lipozom formülasyonlarının veya parçalanma sonucu açığa çıkan metabolitlerinin hücre düzeyinde herhangi bir toksik etkisi olmadığının, in vivo çalışmalarda da vücutta olumsuz herhangi bir toksik veya karsinojenik yanıta sebep olmayacağının kanıtıdır.

Her iki hücre hattında da folat ile aktif hedefli tek veya iki ilaç içeren lipozom formülasyonlarının, folat ile aktif hedefli olmayan tek veya iki ilaç içeren lipozom formülasyonlarına göre sitotoksisitesinin daha düşük olduğu gözlenmekle birlikte, bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0.05). Bu sonuç aktif hedefli

olmayan lipozom formülasyonlarının hücre membranında non-spesifik tutulumuna bağlı olup, Bölüm 4.10.2’de akım sitometri analiz sonuçları ve Bölüm 4.10.3’te radyoişaretli lipozomların in vitro tutulumlarının verildiği sonuçlar ile uyumludur.

Her iki hücre hattında da folat ile aktif hedefli veya aktif hedefli olmayan iki ilaç içeren lipozom formülasyonları, tek ilaç içeren formülasyonlara göre anlamlı derecede daha toksik bulunmuştur (p<0.05). Bu sonuç kombine terapinin kanser hücrelerini öldürmede tek ilaçlara göre daha etkili olduğunu göstermekte olup literatür ile uyumludur (309).

LLC-1 Hücre Canlılığının Akım Sitometri ile Değerlendirilmesi

MTT analizinin aksine akım sitometride kullanılan PI boyası ölü hücrelerin içerisine girmektedir. Dolayısıyla MTT yukarıda da bahsedilen 3 parametre (i.hücre canlılığı, ii.hücre metabolizması, iii.erken apoptotik süreçte olan canlı hücrelerin varlığı) üzerinden hücre canlılığını gösterirken, akım sitometride direkt olarak ölü hücre yüzdesi bulunabilmektedir. Bu açıdan akım sitometri analizi sitotoksik aktiviteyi, MTT’ye göre daha doğru biçimde vermektedir.

Tüm lipozom formülasyonları ve serbest ilaç çözeltilerinin LLC-1 hücre hattı üzerindeki sitotoksik aktivitelerinin verildiği Şekil 4.36’da da görüldüğü üzere ilaç içermeyen folat ile aktif hedefli olan veya olmayan lipozom formülasyonları LLC-1 hücre hattında sitotoksik etki göstermemiş olup, biyouyumlu bulunmuştur (309).

Folat ile aktif hedefli veya aktif hedefli olmayan lipozomal ilaçların serbest ilaçlar ile aynı konsantrasyonda benzer sitotoksik aktivite göstermesi (p>0.05), lipozom formülasyonuna hapsedilen ilaçların sitotoksik aktivitesinde azalma olmadığını göstermektedir.

Folat ile aktif hedefli olmayan iki ilaç içeren lipozom formülasyonunun sitotoksik aktivitesi, aktif hedefli olana göre daha yüksek (p<0.05) bulunmuştur. Bu sonuç, Bölüm 4.10.2 ve Bölüm 4.10.3’te folat ile aktif hedefli olmayan lipozom formülasyonlarının LLC-1 hücre hattında aktif hedeflilere göre daha yüksek oranda tutulması ile uyumludur. Bunun yanı sıra, folat ile aktif hedefli veya aktif hedefli olmayan iki ilaç içeren lipozom formülasyonları tek ilaç içeren formülasyonlara ve iki ilacı birlikte içeren serbest ilaç çözeltisine göre anlamlı derecede daha toksik bulunmuştur (p<0.05). Bu durum lipozomun sahip olduğu lipofilisite sayesinde hücre

membranında veya hücre içinde serbest ilaç çözeltisine göre daha yüksek oranda tutulabilmesi ile açıklanabilir.

VNB içeren lipozom formülasyonunun, serbest PCX+ VNB çözeltisi ile benzer sitotoksik aktivite göstermesi lipozomun daha düşük ilaç dozu ile hücre üzerinde öldürücü etkide olduğunu göstermektedir.

Kombine ilaç içeren folat ile aktif hedefli veya hedefli olmayan lipozom formülasyonlarının (Fol-Lipo/PCX/VNB ve Lipo/PCX/VNB) LLC-1 kanser hücreleri üzerinde en yüksek sitotoksik aktiviteyi göstermelerinden yola çıkarak, bu iki formülasyonun tedavi etkinliği açısından optimum formülasyon olduğunu söylemek mümkündür.

5.6. İn Vivo Çalışmalar