Rodaminle Konjuge Lipozom Formülasyonlarının Tümör Hücreleri Tarafından Tutulumunun İn Vitro İncelenmesi

A549 ve H1299 Hücre Hatlarındaki Akım Sitometri Analizi

Akım sitometri floresan yoğunluğuna bağlı olarak akan bir süspansiyon içerisindeki hücrelerin büyüklüğüne ve granülaritesine göre tek hücre seviyesinde kalitatif ve kantitatif ölçüm yapan bir sistemdir. Hücrede yapısal (hücre boyutu, şekli, sitoplazmaik granülite, pigment içeriği, DNA/RNA içeriği, yüzey antijenleri) veya fonksiyonel (enzim aktivitesi, membran devamlılığı, canlılık, redoks hali) pekçok parametre yüksek hassasiyetle, hızlı şekilde tespit edilebilmektedir. Ayrıca akım sitometri hücrelerin fiziksel olarak birbirinden ayrımını etkin bir biçimde yapabilmekte ve spesifik hücrelerin saf örneklerini elde etme gibi ileri analizleri mümkün kılmaktadır. Bu avantajları sebebiyle floresans özellik gösteren lipozom formülasyonlarının hücre içerisinde tutulum miktarlarını kantitatif olarak tespit etmek için akım sitometri tercih edilmiştir.

Bölüm 3.12.2’de anlatıldığı şekilde rodaminle konjuge lipozom formülasyonlarına ilişkin akım sitometri analizinin sonuçları Şekil 4.29’da verilmiştir.

Folat ile aktif hedefli olan (Fol-Lipo) ve olmayan (Lipo) lipozom formülasyonlarının her iki hücre hattında da tutulduğu görülmektedir.

A549 hücre hattında Lipo formülasyonlarının Fol-Lipo formülasyonuna göre daha yüksek oranda (p<0.05) tutulması, spesifik olmayan bir tutulum olup, A549 hücre hattında folat reseptör ekspreyonunun yüksek düzeyde olmaması ile ilişkilidir. Bu bulgu literatürle uyumludur. Literatürde A549 hücre hattının folat reseptör ekpspresyonun düşük düzeyde olduğunu göstermek için, folat ile aktif hedefli nanopartikülün normal ortam ile folik asit içermeyen ortamdaki tutulumları karşılaştırılmıştır. Nanopartiküllerin folik asit içermeyen ortamda folat reseptör ekspresyonu yüksek olan hücre hattında tutulumu daha yüksek bulunurken, A549 hücre hattındaki tutulumunun değişmemesi nanopartiküllerin A549 hücreleri içerisine folat reseptöründen bağımsız olarak alındığının işaretidir (234).

H1299 hücre hattında Fol-Lipo formülasyonu A549 hücre hattına göre daha yüksek oranda (p<0.05) tutulmuştur, bu sonuç Bölüm 4.10.1’de H1299 hücre hattının daha yüksek oranda folat reseptör ekspresyonuna sahip olduğu sonucu ile uyumludur.

Ayrıca Fol-Lipo formülasyonunun, aktif hedefli olmayanlara göre H1299 hücreleri içinde daha yüksek oranda tutulması (p<0.05), Fol-Lipo formülasyonunun hücre içine folat-reseptör aracılığı ile girdiğinin göstergesidir. Bu bulgular literatür ile uyumludur.

Literatürde, H1299 hücrelerinin folat reseptör ekspresyonunun yüksekliği Western-blot analizi ile gösterilmiş ve folat reseptörüne hedefli nanopartiküllerin H1299 hücrelerindeki tutulumları, düşük düzeyde folat reseptörü eksprese eden hücre hattına göre önemli derecede yüksek bulunmuştur (235).

Ulaşılan bulgular ve literatürdeki bilgilerden yola çıkarak H1299 hücre hattının folat ile hedeflenen ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinliklerini göstermek ve aktif hedefli olmayan formülasyonlar ile karşılaştırmak için uygun bir hücre hattı olabileceği çıkarılabilir. Ayrıca A549 hücre hattının da folat ile hedeflenen ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinliklerini gösterirken negatif kontrol olarak kullanılmasının uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

A549 ve H1299 Hücre Hatlarının Floresans Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Rodaminle konjuge folat ile aktif hedefli (Fol-Lipo) ve aktif hedefli olmayan (Lipo) lipozom formülasyonlarının A549 ve H1299 hücre hatlarında 1 saatlik inkübasyon süresi sonunda alınan floresans mikroskop görüntüleri Şekil 4.30’da verilmiştir.

Alınan görüntüler, Lipo ve Fol-Lipo formülasyonlarının A549 hücrelerinin daha çok hücre membranında non-spesifik olarak tutulduğunu göstermektedir. H1299 hücrelerinde ise Lipo ve Fol-Lipo formülasyonlarının hücre membranında non-spesifik olarak tutulduğu görülmekle birlikte, Fol-Lipo formülasyonunun folat reseptör aracılığıyla hücre içerisine girdiği de saptanmıştır. Bu görüntüler, bölüm 4.10.1’deki folat reseptör analizi sonuçları ve Bölüm 4.10.2’deki akım sitometri analizi sonuçları ile uyumludur.

LLC-1 Hücre Hattında Akım Sitometri Analizi

Rodaminle konjuge folat ile aktif hedefli (Fol-Lipo) ve aktif hedefli olmayan (Lipo) lipozom formülasyonlarının LLC-1 hücre hattındaki 4 saatlik inkübasyon süresi sonunda yapılan akım sitometri analizinin sonuçları Şekil 4.31’de verilmiştir. Bu

grafiğe göre, hem pasif hedefli hem de folat ile aktif hedefli lipozom formülasyonlarının hücre içinde yüksek oranda tutulabildiği, pasif hedefli lipozomların ise aktif hedeflilere göre hücredeki tutulumlarının daha yüksek olduğu (p<0.05) görülmüştür. Bu durum pasif hedefli lipozomların hücre membranında spesifik olmayan tutulum gösterirken, aktif hedefli lipozomların hücre içerisine daha kontrollü girmesi ile açıklanabilir.

Hem Lipo hem Fol-Lipo formülasyonlarının LLC-1 hücrelerinde yüksek tutulum göstermesi literatürle uyumludur. Literatürde folat ile aktif hedefli ve aktif hedefli olmayan lipozom formülasyonlarının, LLC-1 hücre hattında yüksek oranda tutulduğu gösterilmiş olup, aktif hedefli lipozomların hedefli olmayanlara göre LLC-1 hücrelerinde daha yüksek oranda tutulduğuna dair bulgular mevcuttur. Ancak bu bulgulara folat içermeyen ortam kullanılarak ulaşılmıştır (302).

Literatürdeki bilgilerden folat reseptör ekspresyonu yüksek olduğu anlaşılan ve akım sitometri analizi sonucu Fol-Lipo formülasyonunun yüksek oranda tutulduğu saptanan LLC-1 hücreleri ile oluşturulan in vivo tümör modelinin folat ile aktif hedefli ilaç taşıyıcı sistemlerinin etkinliklerinin test edilmesi için uygun olduğunu söylemek mümkündür.

LLC-1 Hücre Hattının Floresans Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Rodaminle konjuge folat ile aktif hedefli (Fol-Lipo) ve aktif hedefli olmayan (Lipo) lipozom formülasyonlarının LLC-1 hücre hattındaki 2 saatlik inkübasyonları sonrasında alınan floresans mikroskop görüntüleri Şekil 4.32’de verilmiştir.

Görüntülerden de anlaşıldığı üzere, her iki formülasyon da hücrelerde tutulurken, Lipo formülasyonu, Fol-Lipo formülasyonuna göre hücre membranında folat reseptöründen bağımsız non-spesifik olarak daha çok tutulmaktadır. Bu sonuç, Bölüm 4.10.2’deki akım sitometri analizi sonuçları ile uyumludur.

5.5.3. ^99mTc İşaretli Lipozom Formülasyonlarının Tümör Hücreleri Tarafından Tutulumunun İn Vitro İncelenmesi

99mTc işaretli folat ile aktif hedefli (Fol-Lipo) ve aktif hedefli olmayan (Lipo) lipozom formülasyonlarının hücre hatlarındaki 4 saatlik inkübasyon süreleri sonunda tutulumlarına ilişkin sonuçlar Şekil 4.33’te verilmiştir.

Grafikten de anlaşıldığı üzere, 4 saatlik inkübasyon süresi sonunda 3 hücre hattı için de Lipo formülasyonu, Fol-Lipo formülasyonuna göre hücre membranında daha çok tutulmaktadır (p<0.05). Bu sonuç hücre membranındaki spesifik olmayan tutulumdan kaynaklı olup, Bölüm 4.10.2’de alınan akım sitometri sonuçları ve floresans mikroskop görüntüleri ile uyumludur.

Her iki formülasyon için de 4. saatte hücrelerdeki tutulumları, en yüksekten en düşüğe doğru LLC-1> H1299> A549 şeklinde sıralamak mümkündür (p<0.05).

Ayrıca literatüre (234, 235, 302) ve Bölüm 4.10.2’de verilen akım sitometri analizi sonuçları ile uyumlu olacak şekilde, folat ile aktif hedefli lipozom formülasyonlarının tutulumlarının LLC-1> H1299> A549 şeklinde olması, folat reseptör ekspresyon miktarı yüksek olan hücre hattından düşük olan hücre hattına göre sıralandığını göstermektedir.

Literatürde yapılan çalışmada (303) ^99mTc işaretli monoklonal antikor ile aktif hedefli lipozomların, aktif hedefli olmayan partiküllere göre hücrede daha yüksek oranda tutulduğu gösterilmiştir. Bu sonuç, bizim bulgularımızla ters gözükmektedir.

Ancak akım sitometri analiz sonuçları ve immunfloresans mikroskop görüntülerinde hazırlanan Lipo formülasyonunun hücrede folat reseptöründen bağımsız şekilde non-spesifik tutulması daha yüksek oranda radyoaktivite okunmasına sebep olmuştur. Fol-Lipo formülasyonu hücre içerisine folat reseptör aracılığıyla daha kontrollü şekilde girmektedir. Bu durum özellikle folat reseptörünün kanserli hücrelere göre daha az eksprese olduğu sağlıklı hücrelerde lipozomların kontrollü şekilde tutulmasına, böylece sitotoksik ilaçların gösterdiği yan etkinin azalmasına katkıda bulunacaktır.

5.5.4. Lipozom Formülasyonlarının İn Vitro Hücre Canlılığına Etkisinin