Bu araĢtırma için Selçuk Üniversitesi Deneysel Tıp Akademisi ve Uygulama Merkezi Etik Kurulu‟ndan (2009/52) onay alınmıĢtır. ÇalıĢma aynı merkezden temin edilen 32 adet 20 günlük erkek „„Wistar‟‟ cinsi ratlar üzerinde yürütüldü. Aynı merkezde; hayvanlar dörderli gruplar halinde ayrı ayrı kafeslere konularak, araĢtırma boyunca standart koĢullar altında (oda sıcaklığı 20 ± 1°C, nispi nem %50 ± 10, 12/12 saat aydınlık karanlık periyodunda), yem ve su kısıtlaması yapılmaksızın günlük bakıma alındılar. Deney hayvanlarından rastgele bir seçimle aĢağıda belirtilen gruplar oluĢturuldu.
2.2. Deney grupları
Yirmi günlük, ortalama 50gr. ağırlıktaki 32 erkek Wistar rat çalıĢmaya dahil edildi. Ratlar deney süresince standart rat yemi ve su ile beslendi. Hayvanlar çalıĢma baĢlangıcında, her birinde 16 hayvan bulunan kontrol ve test grubu olmak üzere iki gruba ayrıldı. Test grubuna, hayvanların büyümesinin baskılanmaması için 1. hafta boyunca toz formundaki nifedipin (125mg/kg) her gün standart rat yemine karıĢtırılarak verildi. Gerekli dozun alınmasını temin etmek amacıyla hayvanların öncelikle nifedipin içeren yemi tüketmesi sağlandı ve daha sonra günlük yem ihtiyacının kalanı verildi. Hayvanlar her gün tartılarak her hayvanın aldığı ilaç miktarı canlı ağırlıklarına göre ayarlandı. Hayvanların klinik durumları her gün kontrol edilerek kaydedildi. Ġkinci haftadan itibaren, sonraki 3 hafta boyunca her gün nifedipin (250mg/kg) aynı yöntemle verildi. Otuzuncu günde ilaç kesildi ve ratlar sadece standart rat yemi ve suyla 40 gün daha (70. güne kadar) beslendi.
Kontrol grubuna 70 gün boyunca sadece standart rat yemi ve su verildi. ÇalıĢmanın 30 ve 70. günlerinde deney ve kontrol grubundan 8‟er hayvan (her dönemde toplam 16‟Ģar hayvan), diĢetinin histolojik ve histomorfometrik değerlendirmeleri için intraperitoneal yolla (ĠP) ketamin HCL (0.2 ml ketamin HCL/100g vücut ağırlığı) verilerek dekapitize edilerek sakrifiye edildi.
32
2.3. Doku örneklerinin alınması, histolojik takip, bloklama ve kesit alma iĢlemleri
Sakrifikasyonu takiben deney hayvanlarının mandibular kemikleri çevre yumuĢak dokuyu da içerecek Ģekilde diseksiyonla çıkarıldı ve tamponlu formal saline (0.1 M, pH 7.4) alındı. Ardından doku örnekleri %10‟luk etilen-diamin-tetra- asetik asit (EDTA) içinde, +4°C‟de, 3 ay süreyle dekalsifiye edildi. Dekalsifikasyonun tamamlandığı radyografiyle teyit edildi.
Dekalsifikasyonu tamamlanan ve bir gece akar su altında yıkanan örnekler daha sonra otomatik doku takip cihazına aktarılarak sırasıyla 70, 80, 90, 96 ve 100‟lük alkollerde birer saat, üç farklı ksilolün her birinde yarımĢar saat ve ksilol- parafinde yarım saat tutuldu. Takiben sert (E.n. 56-58°C) parafinde bloklandı. Hazırlanan bloklardan mikrotomla (SM 2000R, Leica microsystems, Heildelberg, Almanya), poly-L-lizin kaplı lamlara 6 µm‟lik labial lingual kesitler alındı. Kesit alınması esnasında gerek bloklar gerekse mikrotom bıçağı, % 30-40‟lik etanol ile sürekli nemli tutuldu. Kesitler, 37°C‟de gece boyunca kurutuldu. Doku kesitleri, ksilen serisinde deparafizisyonu takiben, konsantrasyonları azalan etil alkol serisinden geçirilerek dehidre edildi ve deiyonize distile suya alındı.
2.4. Histolojik boyama iĢlemleri
Bloklardan alınan 6 µm kalınlığındaki kesitler Crossman‟un üçlü boyası ve Hematoksilen&Eozin boyama yöntemiyle boyandı (Culling ve ark 1985, Bradbury ve Gordon 1990). Apoptotik hücreler, in situ DNA fragmantasyonunu belirleyen TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt)-mediated dUTP-biotin nick- end labeling) metoduyla boyandı (Ohyama ve ark 1997). Bu amaçla in situ apoptozis kiti ( Terminal deoksi nüleotidil transferaz (TdT) – FragEL kit; Oncogene Research Products, Boston, USA ) kullanılarak immünohistokimyasal yöntemle boyandı.
Hazırlanan preparatlar ıĢık mikroskobuyla (Nikon Eclipse E 400, Nikon Corporation, Chiyoda-ku, Japan) equipped with a digital camera (DS Camera Head DS-5M, DS Camera control unit DS-L1) incelenerek gerekli görülen bölgelerin dijital görüntüleri kaydedildi.
33
2.4.1. TdT–FragEL DNA fragmantasyon kiti ile apoptotik hücrelerin boyanması
Kesitler ksilen serisinden geçirilerek deparafinize edildikten sonra distile su ile rehidrasyon sağlandı. Bu aĢamadan itibaren nemlendirici kutuya alınan kesitlerin takip eden iĢlemler boyunca kurumamasına gayret edildi.
Kesitler önce proteinaz K ile oda sıcaklığında 20 dk. tutularak permeabilize edildi. Her boyama iĢleminde kit ile gelen pozitif kontrol preparatı da boyamaya dahil edildi. Takiben kesitler %3 H2O2 „de 5 dk. süre ile oda sıcaklığında
bekletilerek endojen peroksidaz inhibe edildi. Tris tampon solüsyonuyla (TBS) yıkanan kesitler dengeleme (equilibration) tamponu ile oda sıcaklığında 30 dk. bekletildi. Takiben kesitlere TdT labelling reaksiyon karıĢımı damlatıldı ve 37oC‟de
1.5 saat tutuldu. Süre sonunda 100 μl stop solüsyonu damlatılarak oda sıcaklığında 5 dk. tutularak TdT labelling reaksiyonu durduruldu. Takiben kesitlere durdurucu tampon solüsyonu (blocking buffer) damlatılarak 10 dk. inkübe edildi. Daha sonra peroksidaz streptavidin konjugatı damlatılarak nemli kutu içinde oda sıcaklığında 30 dk. bekletildi. TBS ile yıkanan kesitler diaminobenzidin (DAB) ile muamele edilerek kahverengi renk reaksiyonunun oluĢması tamamlanıncaya kadar kontrollü Ģekilde oda sıcaklığında 10-15 dk. tutuldu. Hücre çekirdeklerinin boyanması için kesitler metil green ile oda sıcaklığında 3 dk. muamele edildi. Takiben alkol ve ksilen serilerinden geçirilen kesitler entellan (MERCK) ile kapatıldı. Pozitif kontrol olarak, 0.5 μg/ml aktinomisin D ile apoptozis indüklenen promiyelotik lösemi hücreleri (HL60) kullanıldı (ġekil 1).
Serbest diĢetinin 1/3 koronel kısmında, epitel ve bağ dokusunda, TdT– FragEL DNA fragmantasyon kitiyle yapılan immünohistokimyasal boyamada, pozitif kontrol preparatındaki gibi çekirdekleri koyu kahverengi boyanan hücreler apoptotik hücreler olarak kabul edildi (ġekil 1).
34
ġekil 2.1. Aktinomisin D ile apoptozis indüklenen ve pozitif kontrol
grubu olarak kullanılan promiyelotik lösemi hücreleri (HL60) görülmektedir. Kahverengi çekirdekli hücreler apoptotik hücrelerdir. TdT–FragEL DNA fragmantasyon metodu. Büyütme çizgisi: 100 μm.
Kaydedilen dijital görüntüler, dijital görüntü analiz sistemi ile (BS 200 PRO) analiz edilerek, epitel ve bağ dokusundaki apoptotik hücre oranları belirlendi. Grupların ortalama sonuçları apoptotik hücre sayısı/sayılan toplam hücre X 100= apoptotik hücre yüzdesi (%) olarak ifade edildi.
Elde edilen sayısal veriler istatististiksel yöntemlerle analiz edilerek grupların ortalama değerleri arasındaki farkların önem derecesi belirlendi.
2.5. Histomorfometrik Analizler
Boyanan kesitler ıĢık mikroskobunda (E400, Nicon Eclipse E400, Kawasaki, Kanagawa Japonya) incelendi. Gerekli görülen bölgelerden, farklı büyütmelerde büyütme çizgisi içeren dijital görüntüler kaydedildi. Kaydedilen dijital görüntüler dijital görüntü analiz programıyla (BS 200 PRO, Engineering, Medical Industry and Trade, Ankara, Turkey) analiz edildi. Histomorfometrik ölçümlerde, epitel geniĢliği (Eg), gingival marjin epitel yüksekliği (GMEy), bağ dokusu yüksekliği (By) ve bağ dokusu geniĢliği (Bg) serbest diĢetinin ġekil 2.2‟de görülen bölgelerinde yapıldı.
35
ġekil 2.2. Serbest diĢetinin Ģematik çiziminde histometrik ölçümlerin yapıldığı
bölgeler görülmektedir (Nassar ve ark 2008). Eg, epitel geniĢliği; GMEy, gingival marjin epitel yüksekliği; By, diĢeti bağ dokusu yüksekliği; Bg, bağ dokusu geniĢliğini göstermektedir. Üçlü boyama, büyütme çizgisi: 100μm.
2.6. Ġstatistiksel analizler
Elde edilen sayısal veriler, istatistiksel analiz için Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 15 paket programı kullanıldı. Verilere yapılan ön testler sonunda parametrik yada parametrik olmayan hangi testlerin uygulanacağı belirlendi ve parametrik olmayan testlerin kullanılması uygun bulundu. Ġki bağımsız örneklem için Mann Whitney-U testi kullanıldı. Bağımlı yapı gösteren iki örneklem arasındaki farkı incelemek için Wilcoxon testi kullanıldı.
36
3. BULGULAR: