Genotipik yöntemler

210.2.1. Salg n analizleri için kullan lan yöntemler

2.10.2.1.1.Kromozomal DNA’n n Makrorestriksiyon Analizi ve [(“Pulsed-Field Gel Electrophoresis” (PFGE)]

Tekraralanabilirli inin yüksek olmas nedeniyle, bu yöntem bir çok ara t rmac taraf ndan moleküler yöntemler içerisinde “alt n standart” olarak kabul edilmi tir. Bu yöntem, farkl yönlerden belli sürelerde verilen elektriksel ak m yani “pulse” ile megabaz büyüklüklerindeki moleküller de dahil olmak üzere DNA molekülünün çözümlenmesi, temel prensibine dayan r (70). DNA’n n parçalanmas n n engellenmesi için bakteri hücresi agaroz içerisindeyken DNA elde edilir ve ard ndan uygun restriksiyon endonükleaz enzimleri ile muamele edilir (16,71).

Su lar n çe idine göre farkl olan restriksiyon bölgelerine ba l olarak, restriksiyon endonükleaz DNA’y parçalara ay r r (16). Büyüklükleri 10-800 kb aras nda de i en 5-20 DNA parças bakterinin kromozomal restriksiyon profilini verir (16,71). Makrorestriksiyon analizinde kullan lan enzimler DNA’y seyrek olarak keserler. Bu nedenle ortaya ç kan parçalar, klasik elektroforetik artlarda yürütülmek için çok büyüktür. Bu DNA parçalar n n göçünü sa lamak için elektrik ak m n n yönünün s k olarak de i ti i bir elektriksel alan sa lan r. Böylelikle DNA jel içinde ilerleyebilir (71). Belli büyüklükteki DNA molekülünün reoryantasyonunun ba lamad bir minimum “switching time” aral vard r, yani küçükten büyü e moleküllerin ayr abilmesi için, ilk PFGE zamanlar , elektroforez s ras nda ard k olarak daha yüksek bir de ere ç kart l r. Bu prensip ile k sa ve/veya daha uzun “switch” zamanlar kullan larak küçük ve/veya büyük moleküllerin ayr m sa lanmaktad r (70). PFGE özel ve pahal bir cihaz gerektirmesi haricinde basit ve standart bir tekniktir (71). PFGE de erlendirmesi Tenover ve arkada lar n n kriterlerine göre yap lmaktad r (62). Bu yöntemle PFGE protokolleri ars nda bir uyum yaratm ve bu standart bir terminoloji haline getirilmi tir. Standart uygulama ve de erlendirme kriterlerinin bulunmas , PFGE ile elde edilen sonuçlar n de i ik laboratuarlar aras nda payla lmas n sa lamaktad r (71).

2.10.2.1.2. Ribotiplendirme

Genotiplendirme teknikleri epidemiyolojik çal malar için çok k ymetli veriler elde edilmesini sa lamaktad r. Genotiplendirme amac yla kullan lan PFGE yöntemi alt n standart olmas na kar n pahal ekipman ihtiyac ve tecrübeli laboratuar çal anlar n n olmas n gerektirdi inden, ayn amaca hizmet eden daha ucuz ekipman ve tecrübeli laboratuar çal anlar n n olmas na ihtiyaç duymayan ve de otomatize sistemlerle entegre edilebilen bir moleküler yöntem aray lar bulunmaktad r. Ribotiplendirme yöntemi ribozomal gen bölgeleri içerisindeki DNA dizilerinin de i kenliklerinin saptanmas prensibine dayal bir yöntemdir bu amaçla PZT tabanl ribotiplendirme yöntemlerinde elde edilen amplifikasyon ürünlerinin sekans n n incelenmesi ya da restriksiyon enzimler ile i lemlenmeleri sonras elde edilen bant farkl l klar n n saptanmas na dayal olabilmektedir (72).

Farkl ribotipleme yöntemlerinde ribozomal RNA’lar n proplar yard m yla saptnad hibridizasyon teknikleri de kullan labilmektedir. Bakterilerde birçok gen tek kopya halinde bulunmaktad r, ribozomal gen bölgeleri birçok kopya halinde bulundu undan incelenecek su lar n DNA’s n n izole edilmesi ve restriksiyon enzimleri ile kesilmesinin ard ndan

elektroforez ile DNA parçalar n ayr mlanmas sa lanarak seçilmi prob (rRNA’a özgül) ile hibridize edilebilmektedir. Ribozomal genlerin bir tür içerisinde genellikle korunmu olmas , yöntemin ay r m gücünü azaltsa da, bu yöntemin baz bakterilerin alt tiplerinin belirlenmesinde ba ar l oldu u gösterilmi tir (73).

2.10.2.1.3. “Randomly Amplified Polymorphic DNA” (RAPD) (Arbitrarily Primed (AP PCR) DNA parmak izi analizleri için çe itli PZT bazl yöntemler tan mlanm t r (69). Bu yöntemlerden biri RAPD PZT’d r. Bu yöntemde yakla k 10 bazl k primerler kullan larak bunlar n tutunaca genom boyunca yerle mi rastgele diziler hedef al nmakta ve amplifiye edilmektedir. Ço alt lan ürünler agaroz jelde ayr lmakta ve etidyum bromür ile boyanmaktad r. Tepkimede tek bir rasgele oligonükleotid primeri kullan ld nda, genomdaki homolog sekanslar ile hibridize olmaktad r. E er primer alternatif DNA ipilikçikleri üzerindeki dizilerle hibridize olursa, iki hibridizasyon bölgesi aras ndaki DNA alan amplifiye edilmektedir.

Belirli bir tür için RAPD analizi yap lmas için en iyi sonuçlar n al nd birçok oligonükleotid primerlerinin denenmesi gerekmektedir (74). Ay r m gücünün artt r lmas için birden fazla primerin kullan lmas gerekmektedir. Ancak yöntemin de erlendirme kriterlerinin standart olmay ve tekrarlanabilirli inin dü ük olmas farkl laboratuvarlar aras nda de il ayn zamanda ayn laboratuvar içerisinde bile sorun olu turmaktad r. Bu nedenlerle ortak bir veri taban n n olu turulmas güçtür (71). RAPD, PFGE’den daha kolay uygulanmas nedeniyle s kça ba vurulan bir yöntemdir (66). Avantaj ve dezavantajlar de erlendirildi inde RAPD, salg n ara t rmas nda çabuk bir ön de erlendirme yap lmak istendi inde, daha sonra kullan lacak PFGE gibi referans yöntemler için yararl bir ön çal ma olarak kullan labilir (75).

2.10.2.2. Evrimsel ili kilerin incelenmesi ve ar ivleme .çin Kullan lan Yöntemler 2.10.2.2.1. coa (Koagülaz) Tiplendirme Yöntemi

coa tiplendirme yöntemi S. aureus su lar nda koagülaz enzimine ait coa gen bölgesinin PZT

ile amplifiye edilmesinin ard ndan, AluI gibi restriksiyon enzimleri ile elde edilen kesim ürünlerinin jel elektroforezi ile aard nyr mlanmas ve ortaya ç kan restriksiyon parçalar n n büyüklük polimorfizmindeki farklar n n de erlendirilmesi prensibine dayanmaktad r (76). Ancak bu yöntemde, restriksiyon enzimleri ile PZT ürünlerinin kesimi için uygun inkübasyon süreleri ve

s cakl k ko ullar n n optimizasyonu, ayr ca elektroforez s ras nda kullan lacak ak m ve sürelerinin optimizasyonu gibi ön çal malar gereklidir (77).

2.10.2.2.2 “Multi Locus Sequence Typing” (MLST)

MLST, son y llarda bakterilerin tiplendirilmesinde kullan lan yeni bir yöntemdir. Yöntem, yedi yap sal (house-keeping) gene ait k sa internal fragmanlar n dizi analizine dayanmaktad r (78). MLST analizi, hastal k etkeni ve antibiyotiklere dirençli bakterilerin karakterize edilmesi ve izlenmesinde kullan l bir yöntemdir. Verilerin merkezi bir veri taban nda toplanmas ve birbirleri ile bir programla kar la t r labildikleri için di er yöntemlere göre daha standartt r. Verilerin web üzerinde de erlendirilebilmesi için baz bilgisayar programlar geli tirilmi tir. Bunlardan biri olan “mlstdb” program Chan ve ark. taraf ndan geli tirilmi tir (78). Bu programa (http://www.mlst.net) internet adresinden ula labilmektedir.

MLST, dizi analizi bazl bir yöntem olup epidemiyolojik çal malara küresel bir yakla m getirmektedir. Bu yöntemde, yap sal (house-keeping) genlerden elde edilen yakla k 500 baz çiftlik yedi tane internal gen parças n n dizi analizi yap lmaktad r. Bu amaçla arcc,aroe,glpf,gmk,pta,tpi ve yqil genlerine ait dizi analizleri yap lmaktad r. Bakteriye her bir gen dizisi için o diziye özgü bir allel numaras verilmekte ve yedi lokuste bulunan allel numaralar n n birle tirilmesi ile bir “allelik profil” olu turulmaktad r. Benzer ekilde, bu allelik profiller de ortaya ç kar ld kça numaraland r lmaktad r. Bu numaralar “dizi tipi (sequence type)” olarak adland r lmaktad r. Tek bir nükleotid farkl l bile su un yeni bir allel numaras almas n gerektirir. Elde edilen ST (sequence type) bilgileri nümerik karekterlerden veriler olduklar ndan matematiksel olarak bu sekans tiplerini farkl yakla m yöntemleri ile yine www.mlst.net web adresinden ula labilen, BURST (Based Upon Related Sequence Types), NRDB (NON- REDUNDANT DATABASES - allele assignment), LINKAGE DISEQUILIBRIUM ve SPLITS- TREE gibi on-line olarak analiz yapabilen alt filo-genetik analiz modülleri yer almaktad r (1). MLST, infeksiyöz hastal klar n izlenmesinde uluslararas payla m m n ve ileti imin sa lanmas için ümit verici bir yöntemdir. Web sitesinde ara t rmac lar bulgular n kar la t rabilmekte ve ortak bir veri taban geli tirebilmektedirler. Ancak bu yöntemin yayg n olarak kullan labilmesi, laboratuvarla n dizi analizlerini ekonomik olarak uygulayabilecek teknik ekipmana sahip olmas na ba l d r (1,35).

2.10.2.2.3. spa Tiplendirme

Frénay ve arakada lar (79). S. aureus’un protein A (spa) geninin polimorfik X bölgesindeki bir tek-lokus dizi analzi yöntemi geli tirmi lerdir. spa tiplendirmesinin MLST’ye göre ba l ca üstünlü ü daha kolay uygulanabilir olu u ve sadece tek bir bölgenin dizi analizini gerektirmesidir. spa tiplendirmesinin ay rtedici gücü PFGE ve MLST’nin aras nda bir de erdedir. MLST’den farkl olarak, spa tiplendirmesi MRSA’lar n hem moleküler evriminin hem de hastane salg nlar n n ara t r lmas için uygundur. spa tiplendirmesinin avantaj ara t r c lar n “in-house” sekanslama platformlar n kullanarak haz rlanm yaz l m programlar yla sonuçlar n de erlendirilebilmesidir.

Koreen ve arkada lar (80) ve Harmsen ve arkada lar (81) taraf ndan spa tiplendirme için tüm dünyada kullan lan iki farkl terminoloji sistemi tan mlanm t r. Maalesef her iki çal mac n n terminoloji sistemindeki farkl l klar yay nlanan spa tiplendirmesi verilerinin kar la t rmas n güçle tirmektedir. Bugüne kadar Ridom StaphType software (Ridom GmbH, Wurzburg, Germany) Avrupa’da spa sekanslar n n analizinde geni ölçüde kullan lmaktad r. Laboratuardaki tiplendirme sonuçlar internet yolu ile merkezi spa server ile senkronize bir

ekilde kar la t r lmaktad r (http://www.spaserver.ridom.de). Bu web sitesi European SeqNet.org taraf ndan ba lat lan evrensel bir terminolojiye sahip olmak üzere geli tirilmi bir veritaban d r. Bu veritaban Avrupa’n n 36 farkl ülkesinde izole edilmi 13000’den fazla izolata ait 100 farkl spa tekrar n n kombinasyonundan olu an 1200’den fazla spa tipi içermektedir. Bu yüzden S. aureus’la ilgili en geni sekans bazl veritaban d r. spa tiplerine ait bilgilerin bir arada toplanmas n n enfeksiyon kontrolünün devaml l n sa lamak ve elektronik ortamda erken uyar sistemi olu turarak MRSA su lar n n hastane düzeyinde yayg nl n belirlemek gibi avantajlar vard r (1).

3. GEREÇ VE YÖNTEM