T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS SU LARINDA
PANTON VALENT N LÖKOS D N (PVL)
VARLI ININ POL MERAZ Z NC R TEPK MES
YÖNTEM LE ARA TIRILMASI
BAHAR ERYONAR
M KROB YOLOJ VE KL N K M KROB YOLOJ ANAB L M DALI
YÜKSEK L SANS TEZ
T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜN VERS TES
SA LIK B L MLER ENST TÜSÜ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS SU LARINDA
PANTON VALENT N LÖKOS D N (PVL)
VARLI ININ POL MERAZ Z NC R TEPK MES
YÖNTEM LE ARA TIRILMASI
Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal%
YÜKSEK L SANS TEZ
BAHAR ERYONAR
Dan%'man Ö)retim Üyesi
Prof.Dr.ZEYNEP GÜLAY
Bu ara't%rma DEÜ Bilimsel Ara't%rma Projeleri 0ube Müdürlü)ü taraf%ndan 2005.KB.SA .081 say% ile desteklenmi'tir.
“Staphylococcus aureus su lar nda Panton Valentin Lökosidin (PVL) varl n n Polimeraz Zincir Tepkimesi yöntemi ile ara t r lmas ” isimli bu tez 18.11.2008
tarihinde taraf m zdan de erlendirilerek ba ar l bulunmu tur.
Jüri Ba kan
Prof. Dr. Zeynep GÜLAY
Jüri Üyesi Jüri Üyesi
Prof. Dr. Hakan ABACIO LU Prof. Dr. Mine YÜCESOY
Jüri Üyesi Jüri Üyesi
Ç NDEK LER TABLO D Z N ...I EK L D Z N ...II KISALTMALAR...III ÖZET...IV SUMMARY...VI 1.G R VE AMAÇ...1 2.GENEL B LG LER ...3
2.1. Tarihçe ve s n fland rma...3
2.2. Staphylococcus aureus’un Üreme Özellikleri, Hücre Duvar Yap s ve Biyokimyasal Özellikleri...4
2.2.1.Üreme ve Tür Özellikleri ...4
2.2.2. Mikrokapsül Yap s ...4
2.2.3. Hücre Duvar ...5
2.3. S. aureus’un Virulans Faktörleri ...6
2.3.1. Hücre Duvar Elemanlar ...6
2.3.2. Enzimleri ...8 2.3.2.1. Katalaz...8 2.3.2.2. Koagülaz...8 2.3.2.3. Fibrinolizin ...8 2.3.2.4. Hiyaluronidaz ...9 2.3.2.5. Lipaz...9 2.3.2.6. Nükleaz...9 2.3.3. Ekzotoksinler...9
2.3.3.1. Hemolizinler...9
2.3.3.1.1. Alfa hemolizin (Alfa toksin) ...10
2.3.3.1.2. Beta hemolizin (Beta toksin) ...10
2.3.3.1.3. Gama hemolizin (Gama toksin) ...10
2.3.3.1.4. Delta hemolizin (Delta toksin) ...10
2.3.3.2. Panton Valentin Lökosidinin (PVL) ...10
2.3.3.3. S. aureus’un epidemiyolojik özellikleri ...14
2.3.3.4. Eksfoliatif toksin ...15
2.3.3.5. Enterotoksinler ...16
2.3.3.6. Toksik =ok Sendromu Toksini-1 (TSST-1) ...16
2.4. Virulans Genlerinin Düzenlenmesi ...18
2.5. Patogenez ve Yapt @ Hastal klar ...18
2.6. Stafilokoklar n Laboratuar Tan s ...20
2.6.1. Gram Boyama ve mikroskobik inceleme ...20
2.6.2. Koloni Morfolojisi...20
2.6.3. Katalaz Testi...20
2.6.4. S. aureus’u di@er stafilokoklardan ay ran yöntemler ...21
2.6.4.1. Lam Koagülaz Testi ...21
2.6.4.2. Tüp Koagülaz Testi ...21
2.6.4.3. Mannitol Hidrolizi...21
2.6.4.4. Protein A Saptanmas ...21
2.6.4.5. H zl Termonükleaz Testi...22
2.7. Stafilokok Bnfeksiyonlar n n Tedavisinde Kullan labilen Antibiyotikler ...22
2.7.1. Hücre Duvar Sentez Bnhibitörleri ...22 2.7.1.1. Beta-laktam Antibiyotikler...22 2.7.1.1.1. Penisilinler...23 2.7.1.1.2. Sefalosporinler ...23 2.7.1.1.3. Karbapenemler ...23 2.7.1.2. Glikopeptit Antibiyotikler ...24
2.7.2. Protein Sentez Bnhibitörleri ...24
2.7.2.1. Aminoglikozidler ...24 2.7.2.2. Makrolidler...24 2.7.2.3. Oksazolidinonlar (Linezoid) ...24 2.7.2.4. Streptograminler...25 2.7.2.5. Linkozamidler ...25 2.7.2.6. Kloramfenikol ...25
2.7.3. Nükleik Asit Sentezi Bnhibitörleri ...25
2.7.3.1. Sülfonamidler ve Trimetoprim...25
2.7.3.2. Kinolonlar...25
2.7.3.3. Rifampin...26
2.8. Stafilokoklarda metisilin direnci ve epidemiyolojisi...26
2.9. Staphylococcus casette chromosome mec (SCC mec) ...27
2.10. Staphylococcus aureus’un Moleküler Epidemiyolojisi ve Tiplendirme Yöntemleri...29
2.10.1.Fenotipik yöntemler ...29
2.10.1.2.Biyotiplendirme...30
2.10.1.3.Faj tiplendirme ...31
2.10.1.4.Multilokus Enzim Elektroforezi (MLEE) ...31
2.10.2.Genotipik yöntemler...31
210.2.1. Salg n analizleri için kullan lan yöntemler...31
2.10.2.1.1.Kromozomal DNA’n n Makrorestriksiyon Analizi ve [(“Pulsed-Field Gel Electrophoresis” (PFGE)] ...31
2.10.2.1.2. Ribotiplendirme...32
2.10.2.1.3. “Randomly Amplified Polymorphic DNA” (RAPD) (=Arbitrarily Primed (AP PCR) ...33
2.10.2.2. Evrimsel iliKkilerin incelenmesi ve arKivleme Bçin Kullan lan Yöntemler...33
2.10.2.2.1. coa (Koagülaz) Tiplendirme Yöntemi ...33
2.10.2.2.2 “Multi Locus Sequence Typing” (MLST) ...34
2.10.2.2.3. spa Tiplendirme...35
3. GEREÇ VE YÖNTEM ...36
3.1.Bzolatlar...36
3.2. Multipleks Polimeraz zincir tepkimesi (PZT) ile pvl Varl @ n n AraKt r lmas ...38
3.2.1 Staphylococcus aureus Kolonilerinden DNA eldesi ...38
3.2.1.1.Akromopeptidaz Yöntemi ...39
3.2.2. pvl/nuc Multipleks PZT Uygulamas ...39
3.2.2.1. Multipleks PZT için kullan lan Malzemeler ...39
3.2.2.2. pvl/nuc Multipleks PZT için kullan lan öncüller ...40
3.2.2.3. pvl/nuc Multipleks PZT Kar K m n n Haz rlanmas ...41
3.2.2.5. Sonuçlar n de@erlendirilmesi...42
3.3. 16S/mec/nuc Multipleks Polimeraz zincir tepkimesi (PZT) ...42
3.3.1. 16S/mec/nuc Multipleks PZT Bçin Kullan lan Öncüller...42
3.3.2. 16S/mec/nuc Multipleks PZT Kar K m n n Haz rlanmas ...43
3.3.3. 16S/mec/nuc Multipleks PZT Thermal Cycler Program ...43
3.3.4 Sonuçlar n De@erlendirilmesi...44
3.4. Pulsed Field Jel Elektroforezi Uygulamas ...44
3.5. Jelin boyanmas ve görüntülenmesi ...46
3.6. PFGE paternlerinin de@erlendirilmesi...46
4. BULGULAR ...48
4.1. Klinik Bzolatlar n Multipleks PZT (nucA/ pvl) Sonuçlar ...48
4.2. PVL-pozitif izolatlar n 16SrRNA/mec/nuc PZR sonuçlar ...51
4.3. PVL-pozitif izolatlara uygulanan PFGE’nin Sonuçlar ...52
5. TARTI MA ...55
6. SONUÇ VE ÖNER LER ...60
TABLO D Z N
Tablo 1: Stafilokoklar’da dört serotipin kapsüler polisakkaritlerinin
tekrarlayan üniteleri... 5
Tablo-2: S. aureus’un adezinleri ve hedefleri ... 7 Tablo 3: S. aureus izolatlar n n kliniklere göre da l m ...36 Tablo 4: Yatan hastalardan ve poliklinik hastalardan gönderilen klinik
örneklerin da l m ...38
Tablo 5: pvl/nuc Multipleks PZT için kullan lan öncüller ...41 Tablo 6: Multipleks PZT’de kullan lan öncüller...43 Tablo 7: .zolatlar n örnek tipleri ile MRSA ve MSSA olanlar n n PVL
EK L D Z N
ekil 1: Stafilokoklar n 16S rRNA tabanl filogenetik a ac ...3
ekil 2: PVL arac l kl doku nekrozu ...12
ekil 3: PVL’nin neden oldu u , PMN hücrelerindeki apoptoz ve doku nekrozu ...13
ekil 4: Bugün geçerli olan CA-MRSA orijini...15
ekil 5: Süperantijenik uyar m...17
ekil 6: Çal 3mam zdaki baz izolatlara ait multipleks PZT sonuçlar örnekler...50
ekil 7: PVL-pozitif izolatlar n mec-nuc PZT sonuçlar ...52
ekil 8: Çal 3mam zdaki PVL pozitif saptanan tüm izolatlar n PFGE görüntüleri ...53
ekil 9: PVL-pozitif Staphylococcus aureus su3lar ile Kontrol (EMRSA-2, EMRSA-6, NCTC8325) su3lar n n makrorestriksiyon analizi sonucu elde edilen Jakards katsay lar kullan larak ve Mega Version 3.1 bilgisayar program nda UPGMA yöntemi kullan larak olu3turulan dendrogram ...54
KISALTMALAR
PZT : Polimeraz Zincir Tepkimesi
MRSA : Metisilin dirençli Staphylococcus aureus
MSSA : Metisilin duyarl Staphylococcus aureus
PVL : Panton-Valentin lökosidin
PFGE : Pulsed-field gel electrophoresis
CA-MRSA : Toplum kökenli metisilin dirençli
Staphylococcus aureus
HA-MRSA : Hastane kökenli metisilin dirençli
Staphylococcus aureus
AP-PCR : Arbitrarily-primed Polimerase Chain Reaction
VNTR : Variable Number Tandem Repeats
NAG : N-asetil glukoz amin
NAM : N-asetil müramik asit
MSCRAAM : Microbial Surface Component Recognizing
Adhesive Matrix Molecules
IgG : Immunglobulin G
LPXTG : Leu-Pro-X-Thr-Gly motifi
PNSG : poli-N-süksinil-.-1,6 glukozamin
tPA : doku plazminojen aktivatör
TSSI : Toksik 3ok Sendromu Toksini
TNF : Tümör Nekroz Faktör
IFN : 5nterferon
BK :Beyin Kalp 5nfüzyon S v Besiyeri
TE EKKÜR
E itimim ve bu çal mam süresince bana her türlü deste i veren dan man m Say n Prof Dr. Zeynep Gülay’a, e itimimde eme i geçen tüm hocalar ma, desteklerinden dolay çal ma arkada lar ma ve hayat m boyunca daima yan mda olan aileme te ekkür ederim.
ÖZET
Staphylococcus aureus Su lar nda Panton Valentin Lökosidinin (PVL) varl n n
Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Ara t r lmas
Staphylococcus aureus, virulans faktörlerine ba l olarak insanda deri infeksiyonlar ndan septisemiye kadar de i en pek çok infeksiyona yol açabililen bir patojendir. S. aureus’un virulans faktörlerinden Panton-Valentin lökosidin (PVL), doku nekrozuna yol açan bir sitotoksindir. PVL ayn zamanda son y llarda çe itli ülkelerde ortaya ç kan toplum kökenli MRSA (metisiline dirençli S. aureus) su lar n n önemli bir virulans faktörüdür. Bu su lar, sa l kl çocuklar ve genç eri kinlerde nekroz ile seyreden yumu ak doku ve akci er infeksiyonlar olu turma özelli indedir. Bu tip infeksiyonlardaki doku nekrozunun PVL sal n m n n bir sonucu oldu u bildirilmektedir. Bu çal mada amac m z farkl ehirlerde (.zmir, Ankara, .stanbul) üretilmi klinik izolatlarda, pvl genine ait 433 bp uzunluktaki, bir bölgeye özgü primerler kullan larak ilgili genin varl n ara t rmak ve PVL-pozitif bulunan su lar n klonal ili kilerini “pulsed-field gel electrophoresis” (PFGE) tekni i ile de erlendirmektir.
Çal mam zda, luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile S. aureus’a özgü DNAaz genine ait nuc-1 ve nuc-2 primerleri kullan larak nuc ve pvl genlerini e zamanl olarak saptayan bir multipleks PZT yöntemi uygulanm t r. Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi Hastanesi, Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi Çocuk Hastanesi ve .stanbul Üniversitesi Çapa T p Fakültesi Hastanesi’nden 2005-2007 y llar nda klinik örneklerden izole edilen toplam 299
Staphylococcus aureus su u (99 MRSA 200 MSSA) bu yöntemle incelenmi tir. Ayr ca PVL
üreten izolatlar n genellikle k sa süreli klonal ili kilerin ortaya konmas nda “alt n standart” olarak kabul edilen PFGE yöntemi ile klonal ili kileri ara t r lm t r.
Çal maya al nan 299 izolat n 11’i (1 MRSA, 10 MSSA) (% 3.67) PVL-pozitif olarak saptanm t r. Metisiline heterorezistan izolatlar n rutin duyarl l k testlerinde saptanmalar nda güçlük olabildi i için PVL-pozitif izolatlar n tümüne ayn zamanda 16S/mec/nuc multipleks PZT uygulanm ve metisilin direnci de erlendirilmi tir. Bunun sonucunda Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi Çocuk Hastanesi’nden MSSA olarak gönderilmi bir izolat n mec geni ta d yani MRSA oldu u saptanm t r. MRSA izolatlar aras ndaki oran % 1 (1/99), MSSA izolatlar aras ndaki oran % 5 (10/200)‘tir. PVL-pozitif tek MRSA izolat Hacettepe Üniversitesi Çocuk Hastanesi’nden gelen bir kan örne inden üretilmi tir. PVL-pozitif MSSA izolatlar n n merkezlere göre da l m ; Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi hastanesi’nden 6 izolat, Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi Çocuk Hastanesi’nden 3 izolat, .stanbul
Üniversitesi Çapa T p Fakültesi Hastanesi’nden 1 izolat eklindedir. Gönderilen MSSA su say s na göre oranlar; Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi’nde % 10 (6/59), Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi Çocuk Hastanesi’nde MSSA için % 4.8 (3/62) ve MRSA için % 2.6 (1/38), .stanbul Üniversitesi Çapa T p Fakültesi Hastanesi’nde % 1.25 (1/79) olarak belirtilmi tir.
PVL-pozitif izolatlar n % 18’i (2/11) kandan (1 MSSA, 1MRSA), % 82’si (9/11) yara kültürlerinden izole edilmi tir. Dokuz Eylül Üniversitesi PVL-pozitif izolatlar n n kliniklere göre da l m % 50 (3/6)’si Kad n Hastal klar ve Do um, % 16.6 (1/6)’s Kulak Burun Bo az, % 16.6 (1/6)’s Beyin Cerrahisi ve % 16.6 (1/6)’s Plastik Cerrahi servislerindendir. PVL-pozitif izolatlar n PFGE ile klonal ili kileri incelenmi tir. Dokuz Eylül Üniversitesi izolatlar n n dördü birbiri ile il kili bulunmu tur. Bu izolatlar n makrorestriksiyon paternleri ikili gruplar halinde birbirleri ile identiktir. Her iki grup aras nda da bir bant fark bulunmaktad r. .dentik izolatlardan ikisi iki ayl k bir süre içerisinde farkl servislerden izole edilmi tir. Hacettepe Üniversitesi izolatlar ndan birinin makrorestriksiyon paterni de bu gruplar ile benzerdir. Di er izolatlar tamamen farkl su lar olarak de erlendirilmi tir.
Sonuç olarak; özellikle toplum kökenli metisiline dirençli Staphylococcus aureus (CA-MRSA) su lar n n bir göstergesi olan Panton-Valentin lökosidin (PVL)’in, farkl merkezlerden toplanan MSSA ve MRSA izolatlar ndaki oranlar s ras yla % 1.3-10 ve % 0-2 olarak bulunmu tur. Bu oranlar yüksek olmamakla birlikte; klonal olarak birbirleriyle ili kili izolatlar n saptanmas PVL-pozitif su lar n yay lma potansiyelinin bir göstergesi olabilir. Metisilin direncinin rutin yöntemlerle gösterilmesi zor olabilece i için PVL-pozitif izolatlarda
mecA genine yönelik moleküler yöntemlerin uygulanmas toplum kökenli MRSA su lar n n
tan mlanmas nda yard mc olmaktad r.
Anahtar Kelimeler: Panton-Valentin Lökosidin (PVL), metisiline dirençli Staphylococcus
aureus (MRSA), metisiline duyarl S. aureus (MSSA), pulsed field gel electrophoresis
SUMMARY
Investigation of the presence of panton-valentin leucocidin (PVL) with PCR in Staphylococcus aureus isolates
Staphylococcus aureus, is a pathogen causing many infections varying from skin
infections depending on virulence factors to septicaemia. Panton-Valentine Leukocidin (PVL), one of the virulence factors of S. aureus, is a cytotoxin which causes tissue necrosis. Also, PVL is one of the important virulence factors of community acquired MRSA (methicillin resistant S. aureus) strains which appeared recently in several countries. These strains have the feature of forming soft tissue and lung infections accompanying with necrosis in healthy children and young adults. The tissue necrosis in these types of infections is reported as a consequence of PVL release. Our consumption/aim in this study is to investigate the presence of the related gene by using 433 bp long, pvl belonging primers which were obtained in clinical isolates in different countries (Ankara, .stanbul, .zmir) and to evaluate the clonal correlation/relation between the obtained PVL-positive strains with “pulsed-field gel electrophoresis” (PFGE) technique.
In our study, a multiplex PCR method was applied, which simultaneously determines
nuc and plv genes by using luk-PV-1 and luk-PV-2 primers and S. aureus specific DNAase
originated nuc-1 and nuc-2 primers. In total, 299 clinical samples which were collected from Dokuz Eylül University Medical Faculty Hospital, Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital and .stanbul University Çapa Medical University Medical Faculty in 2005-2007 was examined with this method. Also to reveal the short term clonal correlation of PVL producing isolates, the clonal correlation were investigated with PFGE which is accepted as ‘‘the gold standard’’.
The 11 of the 299 isolates (1 MRSA, 10 MSSA) (3.67 %) included in the study were determined as PVL-positive. As there was a difficulty in detecting of the routine sensibility of methisiline heteroresistant isolates, 16S/mec/nuc multipleks PCR was applied totally to the PVL-positive isolates at the same time with methisiline resistance investigation.
Consequently, it was detected that the isolate suppossed to be MSSA from Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital was in fact a MRSA isolate which is carrying mec gene.The rate between the MRSA isolates were detected as 1 % (1/99) and the rate between MSSA isolates were determined as 5 % (10/200). The only PVL-positive MRSA isolate was isolated from a blood sample obtained from Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital. According to the centers, the distribution of PVL-positive MSSA isolates were as
follows; 6 isolates from Dokuz Eylül University Medical Faculty Hospital, 3 isolates from Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital and 1 isolate from Istanbul University Capa Medical University Medical Faculty. The rates according to the number of obtained MSSA strains were determined as 10 % (6/59) in Dokuz Eylül University Medical Faculty Hospital, 4.83 % (3/62) for MSSA and 2.6 % (1/38) for MRSA in Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital and 1.25 % (1/79) in .stanbul University Çapa Medical University Medical Faculty.
18 % (2/11) of PVL-positive MSSA isolates were isolated from blood (1 MSSA, 1MRSA) and 82 % (9/11) were isolated from wound cultures. The distribution of the rates of PVL-positive isolates/clinics for Dokuz Eylül University were; 50 % (3/6) in Gynaecologics and Obstetrics, 16.6 % (1/6) in Otorhinolaryngology, 16.6 % (1/6) in Brain Surgery and 16.6 % (1/6) Plastic Surgery services.
The clonal relation between PVL-positive isolates was investigated with PFGE. It was reported that there was corralation between the four isolates obtained from Dokuz Eylül University. The macrorestriction patterns of these isolates were identical with each other in double groups. Between these two groups a single band pattern difference was found. The two of identic isolates were isolated from different services in two months period. One of the isolates obtained from Hacettepe University have similar macrorestriction pattern with these two groups. Other isolates were evaluated as completely different strains.
As a result; the Panton-Valentine Leukocidin’s (PVL) was an indicator of especially community acquired methisiline resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) strains and MSSA and MRSA isolate rates collected from different centers were found respectively 1.25-10 % and 1.25 % Besides these rates were not high; the detection of clonal correlation between isolates may indicate the potential of PVL-positive strains extension. As detecting the the methisiline resistance with routine methods might be difficult, applying molecular methods specific to mecA gene in PVL-positive isolates would be helpful for the characterization of the community acquired MRSA strains.
Key words: Panton-Valentin Leucocidin (PVL), methicillin resistant Staphylococcus aureus
(MRSA), methicillin sensitive S. aureus (MSSA), multiplex PCR, pulsed field gel electrophoresis (PFGE)
1. G R VE AMAÇ
Staphylococcus aureus insanda ciddi infeksiyonlara neden olan bir bakteri türüdür. Birçok
farkl virulans faktörüne ba l olarak veya do rudan invazif etki ile, yumu ak doku infeksiyonlar ndan pnömoni, bakteriyemi ve toksik ok sendromuna kadar de i en klinik tablolara yol açabilmektedir. Bu patojenin tedavide kullan lan antibiyotiklere h zla direnç kazanmas , infeksiyonlardaki mortalite ve morbiditeyi artt rmaktad r. S. aureus izolatlar ndaki en önemli direnç özelli i metisilin direncidir. Metisiline dirençli su lar duyarl su lardaki penisilin ba layan proteinler (PBP) yerine yeni ve dü ük afiniteli bir (PBP 2a) ürettikleri için tüm beta-laktam ajanlara dirençlidir (1). Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) infeksiyonlar 1961’de .ngiltere’deki ilk tan mlanmas ndan bu yana, tüm dünyada, özellikle hastanelerde önemli bir problem haline gelmi tir (2).
S. aureus’un virulans faktörlerinden biri olan PVL, lökositlerin y k m na ve doku
nekrozuna yol açan bir sitotoksindir. PVL, lukS-PV ve lukF-PV diye isimlendirilmi iki adet beraber transkribe edilen gen taraf ndan kodlanmaktad r (3). Bu genler S. aureus kromozomuna integre olmu bir profaj kromozomu (øSa2) ile ta n r (4). pvl geni içeren izolatlar, PVL’ye özgü s n f S (slow:yava ) ve s n f F (fast:h zl ) proteinlerini üretirler (3). PVL ile birlikte di er stafilokok süperantijenlerinin de bulunmas ciddi doku nekrozlar ile sonuçlanabilmektedir (2).
PVL, ayn zamanda son y llarda çe itli ülkelerde ortaya ç kan toplum kökenli metisiline dirençli S. aureus (CA-MRSA) su lar n n önemli bir virulans faktörüdür. Bu su lar, daha önce bilinen risk faktörleri ve hastanede yat öyküsü bulunmayan sa l kl çocuklar ve genç eri kinlerde nekroz ile seyreden yumu ak doku ve akci er infeksiyonlar olu turma özelli indedir. Bu tip infeksiyonlardaki doku nekrozunun PVL sal n m n n bir sonucu oldu u bildirilmektedir (2). CA-MRSA infeksiyonlar sa l kl bireylerde meydana gelmesine kar n morbidite ve mortalitesi a rd r. PVL-pozitif CA-MRSA salg nlar hapisaneler, ordu ve homoseksüel topluluklar gibi kapal ya ayan topluluklarda ve ayn zamanda sporcular, sa l k personeli ve ailelerinde bildirilmi tir (3).
PVL, S. aureus su lar n n % 5’inden daha az taraf ndan üretilmektedir. Lina ve arkada lar n n 171 S. aureus su u ile yapt bir çal maya göre; fronkül ile ilgili su lar n %93’ünde, hemorajik pnömoniden üretilenlerin %85’inde, selulit su lar n n %55’inde, kutanöz
apselerin % 50’sinde, osteomiyelit su lar n n % 23’ünde, t rnak yata infeksiyonlar n n % 13’ünde pvl geni saptam t r (5). Ülkemizde bu konuda yap lan çal malar k s tl d r. Bu konudaki ilk çal ma, 2005-2006 y llar nda Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Bakteriyoloji Laboratuvar ’nda izole edilmi 55 MRSA ve 79 MSSA su unun yer ald çal mad r. Bu çal mada PVL pozitifli i oran % 10.3 olarak saptanm t r ve PVL-pozitif olarak saptanan izolatlar n tümü MSSA su lar d r (6). .stanbul’da yap lan yak n tarihli ba ka bir çal mada ise, 2007-2008 y llar aras nda üretilmi , seçilme kriterleri belirtilmemi MRSA izolatlar nda PVL pozitiflik oran %41, MSSA izolatlar nda ise %24 olarak belirtilmi tir (7). Sonuç olarak ülkemizde yap lan çal malar n say s k s tl d r ve sadece belirli üniversite hastanelerine ba vuran hastalar n izolatlar n içermektedir. Dünya literatürüne bak ld nda da, sadece MSSA izolatlar nda veya tam tersine MRSA izolatlar n n daha yüksek oranda toksin üretti ini bildiren farkl çal malar bulunmaktad r (8,6,9). Dolay s yla sonuçlar co rafi bölgeye ve o bölgede hakim olan S. aureus klonuna göre de i mektedir (6,10,11).
Staphylococcus aureus ve özellikle MRSA izolatlar n n moleküler tiplendirmesinde farkl
teknikler kullan lmaktad r. Bunlar aras nda makrorestriksiyon analizi ve “pulsed-field gel electrophoresis” (PFGE), “arbitrarily-primed PCR” (AP-PCR) ve dizi analizi tabanl teknikler örne in; [“multilocus sequence typing” (MLST); spa ve coa, “Variable Number Tandem Repeats” (VNTR)] say labilir. Bu tekniklerden PFGE bir çok çal mada izolatlar aras ndaki klonal ili kinin incelenmesinde “alt n standart” yöntem olarak kullan lm t r (12,13).
Bu bilgiler nda, bu tez çal mas nda;
1) Ülkemizde farkl ehirlerde (.zmir, .stanbul,Ankara) izole edilen MRSA ve MSSA izolatlar nda pvl varl n n ara t r lmas ,
2.GENEL B LG LER 2.1. Tarihçe ve s n fland rma
Stafilokoklar ilk kez 1878’de Robert Koch taraf ndan tan mlam , 1880’de Pasteur s v besiyerinde üretmi ve 1881’de .skoçyal cerrah Alexander Ogston stafilokoklar n fare ve kobaylar için patojen oldu unu saptam t r. Staphylococcus terimi Grekçe staphyle (üzüm salk m ) tabirinden türetilmi tir ve karakteristik kümelenmeler yapt klar ndan dolay Alexander Ogston taraf ndan seçilmi tir (14). Rosenbach 1884’te beyaz renkli kolonileri Staphylococcus
albus, sar -portakal rengi kolonileri ise Staphylococcus aureus olarak isimlendirmi tir. Bu ay r m
yak n zamana kadar devam etmi tir (15).
Günümüze de in Micrococcaceae ailesi içinde yer alan Staphylococcus genusuna ait 35 tür saptanm t r. Bu türlerin 17’si insan klinik örneklerinden üretilmi tir. Laboratuvarda di er stafilokok türlerinden koagülaz üretme özelli i ile ayr lan Staphylococcus aureus, en patojen stafilokok türüdür. Staphylococcus genusu içinde yer alan ve f rsatç infeksiyon etmeni olarak kar m za ç kabilen di er türler; Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus,
Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus simulans, Staphylococcus capitis, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae’dir (14,16). Nekil
1’de stafilokok türlerinin 16S rRNA dizilerine göre elde edilmi filogenetik a ac görülmektedir (17)
2.2. Staphylococcus aureus’un Üreme Özellikleri, Hücre Duvar Yap s ve Biyokimyasal Özellikleri
2.2.1.Üreme ve Tür Özellikleri
S. aureus, mikroskobik olarak 0.5-1.7 Pm çap nda, Gram pozitif kok eklinde görülen bir
bakteri türüdür. Koklar tek tek, çiftler veya tetratlar veya k sa zincirler halinde bulunabilir (17). Birden fazla düzlemde bölündü ü ve birbirinden ayr lmad ndan tipik üzüm salk m görünümlü düzensiz kümeler olu turur (15).
Hareketsiz olan S. aureus, fakültatif anaeroptur. 18-45 °C’de üreyebilen bu bakterinin
optimal üreme s s 37 °C ve optimal üreme pH’s 7.4’tür (16,18,19).
Makroskobik olarak S. aureus, hem kanl hem de seçici olmayan di er kat besiyerlerinde
h zl üremesiyle karakterizedir (14). S. aureus izolatlar %7.5-10 NaCl içeren besiyerlerinde üreyebilir (11). Katalaz pozitiftir (16,18). Olu turdu u koloniler düzgün, opak, konveks ve 24 saatlik inkübasyonda 1-3 mm çap ndad r. S. aureus izolatlar n n ço u hücre zar ndaki karotenoid yap l pigmentleri nedeni ile alt n sar s renginde koloni olu trurlar. Anaerobik artlarda ve s v besiyerinde üreme, pigment olu umunu azaltan faktörlerdir (16,18). Birçok izolat at, koyun ya da insan kanl besiyerlerinde beta hemoliz yapar (14).
S. aureus, glukoz ve mannitol ba ta olmak üzere birçok karbonhidrattan asit olu turur
(16,19).
2.2.2. Mikrokapsül Yap s
Klinik S. aureus izolatlar polisakkarit yap s nda bir mikrokapsül olu turmaktad r. .mmunotiplendirme sonucunda 11 farkl kapsül tipi tan mlanm t r. Önemli klinik izolatlar n % 70-80’i kapsüler serotip 5 ve 8 içermektedir. Bu iki kapsül tipi, özellikle de tip 8, S. aureus’un di er virulans faktörleri ile de ba lant l d r. Örne in, Toksik Nok Sendrom Toksini üreten S.
aureus’lar n kapsülü tip 8’dir (16,20,21). Tip 5 ve tip 8 kapsüler serotipin tekrarlayan trisakkarit
k s mlar benzerdir ve ayn eker kompozisyonuna sahiptirler. Sadece O-asetilasyon pozisyonu ve amino ekerlerinin aras ndaki ba lar farkl d r. Tip 1, 2, 5 ve 8 serotiplerinin tekrarlayan üniteleri Tablo 1’de gösterilmi tir (22).
Tablo 1: Stafilokoklar’da dört serotipin kapsüler polisakkaritlerinin tekrarlayan üniteleri
Serotip Tekrarlayan Üniteler
Tip 1 S4)-T-D-GalNAcAp(1S4)-T-D-GalNAcAp(1S3)- T –D-FucNAcp(1S Tip 2 S4)-V-D-GlcNAcAp(1S4)- V-D-GlcN(N-asetialanil)AcAp-(1S
Tip 5 S4)-3-O-Ac –V-D-ManNAcAp(1S4)- T-L-FucNAcp(1S3)- V-D-FucNAcp(1S Tip 8 S3)-4-O-Ac- V-D-ManNAcAp(1 S3)- T -L-FucNAcp(1S3)- V-D-FucNAcp(1-
2.2.3. Hücre Duvar
Stafilokok hücre duvar kuru a rl n n %50’sini, birbiriyle ba lant l yakla k 40 katmandan olu an peptidoglikan yap s olu turur (15,23). Peptidoglikanda V(1,4) ba lar ile birbirine ba l N-asetil glukozamin (NAG) ve N-asetil muramik asit (NAM) üniteleri glikan omurgay olu turur. L-alanin, D-glutamik asit, L-lizin ve D-alanil D-alanin aminoasitleri NAM’a ba l peptid zincirini meydana getirir. Stafilokok hücre duvar nda bir penta (tetra) peptit zincirde dördüncü pozisyonda bulunan D-alaninin karboksi terminali ile, bir di er pentapeptiddeki L-lizinin amin grubu pentaglisin köprüleri arac l ile çapraz ba lan r. Çapraz ba lar n say s , su un özelliklerine göre de i ebilir. Örne in, MRSA izolatlar ndaki çapraz ba say s , MSSA izolatlar na k yasla azd r (15,23).
Peptidoglikan tabakan n d nda teikoik asit ve yüzey proteinleri yer almaktad r. Teikoik asit, fosfodiester ba lar ile ba lanarak uzun zincirler olu turan eker- alkol- fosfat polimerleridir. Hücre yüzeyinde bulunan teikoik asit bakteriye antijenik özellik kazand rmaktad r. Stafilokoklarda ribitol teikoik asit bulunmaktad r. Ribitol teikoik asit, peptidoglikandaki NAM’a ba l d r. Teikoik asitin fibronektine ba lanma özelli i nedeniyle stafilokoklar mukozal yüzeylere tutunabilme yetene indedirler (15,24).
Virulans aç s ndan önemli bir yap olan protein A, S. aureus hücre duvar peptidoglikan na kovalan olarak ba l d r. Bu, IgG moleküllerinin Fc bölgesine ba lanabilen özel bir proteindir (16). Molekül a rl 13.000 Daltondur. Stafilokoklarda; ortama sal nan serbest, hücreye ba l ve
hücre d olmak üzere üç tip protein A bulunmaktad r. Protein A, kompleman aktive eder, antifagositik, kemotaktik ve mitojenik etkileri de bulunmaktad r (15).
2.3. S. aureus’un Virulans Faktörleri
S. aureus su lar n n çe itli virulans faktörleri bulunmaktad r. Bu virulans faktörlerini; hücre
duvar elemanlar , enzimler ve ekzotoksinler olarak üç grupta incelemek mümkündür. 2.3.1. Hücre Duvar Elemanlar
S. aureus’un baz virulans faktörleri protein yap dad r ve hücre duvar nda peptidoglikana
ba l olarak bulunurlar. Bu proteinler bakterinin, IgG ve fibrinojen gibi kan proteinlerine veya fibronektin ve kollajen gibi ekstrasellüler matriks proteinlerine ba lanmas na arac l k eder. Bu tip hücre d matriks protenilerine ba lanan yüzey adezinlerine, Adezif Matriks Moleküllerini Tan yan Mikrobiyal Yüzey Elemanlar (‘‘Microbial Surface Component Recognizing Adhesive Matrix Molecules’’; MSCRAMM) denmektedir. S. aureus’un yap kan yüzey proteinleri için iki olas rol dü ünülmü tür. Bunlardan ilki bakterinin kan veya doku komponentleri ile kaplanarak ba kl k sisteminden korunmas n sa lamak, ikincisi ise dokuya ba lanmas n kolayla t rmakt r (25). Yüzey adezinleri S. aureus’un plastik yüzeylere tutunmas ndan da sorumludur. Vücutta bulunan plastik cihazlar ve kateterler, fibronektin, kollajen ve fibrinojen gibi doku proteinleri ve kan tabakas ile h zla kaplan p S. aureus biyofilmi için ilk tabakay olu turur. MSCRAMM hücre içinde sentezlendikten sonra, sitoplazmik membran d na salg lan r. Bu moleküllerin birço u sortaz olarak adland r lan bir enzim taraf ndan peptidoglikandaki pentaglisin köprülerine kovalent olarak ba lan r. MSCRAMM ve sortaz S. aureus’a özgü de ildir. Gram pozitif bakterilerin birço unda bulunmaktad r. Adezin özelli indeki proteinin salg lanmas ve peptidoglikana ba lanmas s ras nda sortaz, salg lanm proteindeki Leu- Pro- X- Thr- Gly (LPXTG) motifini tan r. Adezin proteininin N-terminal ucundaki sinyal dizisi proteini sal n m sürecine yönlendirir. Sal n m s ras nda sinyal dizisi, sinyal peptidaz taraf ndan uzakla t r l r. Bu s rada salg lanm protein, C-terminal ucu ile halen hücreye ba l durumdad r. Sortaz enzimi ile i lem gören proteinler yukar da da belirtildi i gibi LPXTG amino asit motifi ta rlar. Bu dizi, proteinin hücreye ba land membrandan geçen bölümü ile peptidoglikan boyunca uzanan bölgesi aras nda yer al r. Sortaz, LPXTG segmentini threonin ve glisinin aras ndan keser. Kesilen proteinin N-terminal ucunu henüz çapraz ba lant olu turmam bir pentaglisin köprüsüne ba lar.
Böylelikle sortaz ile i lenen proteinler peptidoglikana ba lanarak hücre yüzeyinde yer al rlar (25).
S. aureus yüzey adezinlerinin tamam protein de ildir. Örne in, poli–N-süksinil-V-1,6
glukozamin (PNSG) polisakkarit yap da bir yüzey adezinidir. S. aureus’un yabanc yüzeylerde biyofilm olu turmas ile ilgili olan bu polisakkariti sentezleyen enzimleri kodlayan genler ica olarak adland r l r. PNSG, S.epidermidis su lar taraf ndan da yap lmaktad r. S. aureus’un adezinleri ve hedefleri Tablo 2‘de gösterilmi tir (25).
Tablo 2: S. aureus’un adezinleri ve hedefleri
Adezinler Hedef Fibronektin ba layan protein (FnBP) Fibronektin
Protein A IgG’nin Fc bölgesi
PNSG Plastik Kollajen ba layan protein Kollajen
Koagülaz Protrombin ‘Clumping’ faktör (Ba l Koagülaz) Fibrinojen
Yüzey adezinlerinin hem bakteri yüzeyinde bulunmalar hem de virulanstaki rolleri nedeniyle ba kl k sistemi için iyi birer hedef olu turduklar dü ünülebilir. Ancak fibronektin ba layan proteinlere kar olu turulan antikorlar n özelli i nedeniyle insan ve hayvanlar S. aureus yüzey proteinlerine kar antikor olu tursalar bile infeksiyonlar na kar ba kl k göstermezler. Bu antikorlar stafilokokkal protein FnBP’nin fibronektine ba lanmas n engellemez. Bunun nedeninin antikorlar n fibronektine ba lanm FnBP’ye özgül olmas oldu u gösterilmi tir (25). Bir ba ka yüzeyle ili kili virulans faktörü olan Protein A ise, IgG yap s ndaki antikorlar n Fc k sm na ba lan r. Bu yüzden antikor ba lanmas bakteriyi opsonize etmez ve bakterinin ba k yan ttan kaç n sa lar (25).
Kemotaksis ve fagositozu önleyip, yabanc cisimlere adherans sa layan kapsül yap s ; organizman n eklini verip dayan kl l n sa layan, konakta endojen pirojenlerin yap m n stimüle edip, lökosit kemotaksisine ve abse olu umuna neden olan peptidoglikan; immunkomplekslerin olu umuna ve kompleman n aktivasyonuna neden olan protein A; fibronektine ba lanma özelli i nedeniyle mukozal yüzeylere tutunmaya arac l k eden teikoik asit; kolonizasyonu sa layan yüzey proteinleri, S. aureus’un virulans n artt ran yap sal özelliklerdir (16,20).
2.3.2. Enzimleri
S. aureus, virulans na katk da bulunan çe itli enzimler üretmektedir.
2.3.2.1. Katalaz
Katalaz enzimi tüm stafilokok su lar taraf ndan üretilmektedir. Bu enzim, mikroorganizman n fagositozunun ard ndan fagositik hücreler içinde, miyoloperoksidaz sistemi taraf ndan olu turulan hidrojen peroksiti inaktive etmekte rol al r. Hidrojen peroksit, katalaz n etkisiyle oksijen ve suya parçalan r (14,16)
2.3.2.2. Koagülaz
S. aureus’ta ba l ve serbest koagülaz olmak üzere iki ayr koagüaz bulunmaktad r.
Serbest koagülaz protein yap dad r. Plazmadaki ‘coagulase reacting factor’ (CRF) yi aktive etmekte, bu faktör de fibrinojenin fibrine dönü ümünü sa lamaktad r. Ba l koagülaz ise, ‘clumping factor’ olarak da adland r lmaktad r. Ba l koagülaz plazmadaki fibrinojene direkt olarak ba lan r. Bunun sonucunda, bu faktörün ara t r lmas amac yla yap lan lam koagülaz testinde, stafilokoklar serum ile kar t r ld nda kümele me görülmektedir (16).
Hem serbest hem de ba l koagülaz proteinleri, bakterinin fibrin ile kaplanmas n ve bu ekilde opsonizasyondan ve fagositozdan korunmas n sa lar (16).
2.3.2.3. Fibrinolizin
Stafilokinaz olarak da adland r lan fibrinolizin, fibrin p ht lar n bozup, infeksiyonun kom u dokulara yay lmas na olanak sa lamaktad r (15). S. aureus izolatlar n n hemen hemen hepsi taraf ndan yap lmaktad r. Normalde p ht n n erimesi s ras nda endotelial hücreler, doku
plazminojen aktivatör (tPA) adl bir protein salg larlar. tPA plazminojenle etkile ime girer, fibrin a n parçalayan plazmin adl yap olu ur ve p ht bozulur. Bu i lem sürekli kontrol alt ndad r. Serbest plazmin kanda h zla parçalan r. Fibrinolizin de plazminojeni aktive eder fakat bu yol kontrol edilmez. Fibrinolizin aktivitesi sadece p ht y tahrip etmez, ayn zamanda hücrelerle birlikte yap lan fibrin iplikçiklerini ve ekstrasellüler matriksi de tahrip eder böylece bakteri doku boyunca hareket eder.
Ekstrasellüler matriks, protein ve polisakkaritlerden olu mu tur. S. aureus, fibrinolizin ile birlikte proteazlar ve hiyaluronidaz n etkisiyle ekstrasellüler matriksin bölgesel bozulmas na neden olabilir (16).
2.3.2.4. Hiyaluronidaz
S. aureus su lar n n % 90’ ndan fazlas hiyaluronidaz olu turur. Hiyaluronidaz hiyalüronik
asitleri hidrolize eder. Bu enzim dokuda mukopolisakkaritlerce olu turulan hücreler aras matriksi parçalayarak, organizman n doku içinde yay l m n dolay s yla infeksiyonun yay lmas n kolayla t r r (14,15,16).
2.3.2.5. Lipaz
Bütün S. aureus izolatlar lipaz olu turur. Lipaz, lipidleri hidrolize eder ve bu ekilde stafilokoklar n deri ve deri alt bölgelere yay l m n sa lar. Ayr ca yüzeyel doku infeksiyonlar ndan da sorumludur (15).
2.3.2.6. Nükleaz
Nükleaz tüm S. aureus su lar taraf ndan salg lanmaktad r. Nükleik asitleri parçalayarak S.
aureus’un invazyon yetene ini artt r r (16).
2.3.3. Ekzotoksinler
S. aureus, konak hücrenin fonksiyonunu veya morfolojisini etkilemesi nedeniyle
‘’toksinler’’ olarak tan mlanan çe itli hücre d ürünler üretmektedir (14). 2.3.3.1. Hemolizinler
2.3.3.1.1. Alfa hemolizin (Alfa toksin)
.lk kez 1900 y l nda Kraus ve Clairmant taraf ndan tan mlanm t r. Alfa toksin, S.
aureus’un temel hemolizini olup, S. aureus kültürlerinde olu an beta hemolizin nedenidir. .nsan
trombosit ve makrofajlar ile doku kültürleri hücrelerinde sitolitik etkiye sahiptir. Monositler ise bu toksine dirençlidir (11). Alfa toksin deride nekroza neden olur. Antijeniktir (16,26). Alfa toksin, bakterilerin nötrofillerden kaç nda rol oynar. Ayr ca sitokin üretimini ba latan hücresel zarara neden olarak oka katk sa lar (27).
2.3.3.1.2. Beta hemolizin (Beta toksin)
1935 y l nda Glenny ve Stevens taraf ndan tan mlanm t r. Stafilokokkal sfingomiyelinazd r. Sfingomiyelin üzerine etki ederek eritrositleri hemolizine neden olmaktad r. Antijeniktir (15,16,26).
2.3.3.1.3. Gama hemolizin (Gama toksin)
1938 y l nda Smith ve Price taraf ndan tan mlanm , Mölby Wadströn taraf ndan elde edilmi tir. .nsan, koyun, tav an eritrositlerin bu toksine duyarl , at ve ku eritrositleri ise dirençlidir (16,28).
2.3.3.1.4. Delta hemolizin (Delta toksin)
1947 y l nda Williams ve Harper taraf ndan bildirilmi tir. Antijenik de ildir. Eritrosit, lökosit, makrofaj, lenfosit ve trombositler üzerinde litik etkisi bulunan bir proteindir (16,28).
S. aureus su lar nda alfa ve delta toksin predominant olarak bulunmaktad r.
2.3.3.2. Panton Valentin Lökosidinin (PVL)
Panton Valentin Lökosidin (PVL), lökositlerin y k m na ve doku nekrozuna neden olan S.
aureus’a ait bir sitotoksindir (3). PVL ilk defa 1894’te Van deVelde taraf ndan ‘substance
leukocidine’ (lökositleri öldüren madde) olarak tan mlanm t r. Panton ve Valentine adl ara t rmac lar ise bu lökotoksinin deri ve yumu ak doku infeksiyonlar ile ili kili oldu unu 1932’de aç klam lard r (8). Sonras nda pvl geninin tan mlanmas yla beraber toplum kökenli MRSA (community acquired MRSA; CA-MRSA) izolatlar n n iddetli deri ve yumu ak doku
infeksiyonlar ve nekrotizan pnomoninin PVL ile ili kili oldu u görü ü iyice kuvvetlenmi tir (8). Klinik bulgular da PVL-pozitif S. aureus infeksiyonlar n n PVL-negatif S. aureus infeksiyonlar ndan daha iddetli oldu unu göstermektedir. Örne in PVL-pozitif S .aureus ile ili kili pnömoni daha s kl kla sepsis, yüksek ate , lökopeni, hemoptizis, plevral efüzyon ve ölüm ile seyreder (8). PVL-pozitif S. aureus 'un neden oldu u nekrotizan pnemonilerin özellikle genç ve sa l kl bireylerde iddetli seyretti i ço unlukla da ölümle sonuçland bildirilmektedir (29). Toplum kökenli pnömoni ile PVL üreten S .aureus su lar aras ndaki ili kiyi ilk olarak 1999 y l nda Lina ve arkada lar ortaya koymu lard r (5). Gillet ve arkada lar n n 2002 y l ndaki çal malar na göre PVL-pozitif S. aureus 'un neden oldu u nekrotizan pnömonilerdeki ölüm oran yo un tedaviye ra men %75 olarak bildirilmi tir (30).
PVL, lukS-PV ve lukF-PV diye isimlendirilen, beraber transkribe edilen ve ]Sa2 faj ile ta nan iki gen taraf ndan kodlanmaktad r (3,31). Birbirleriyle sinerjik olarak çal arak monositler, makrofajlar ve polimorfonükleer nötrofilleri y k ma u ratan PVL komponentlerinden S, 38 kDa; F, 32 kDa moleküler a rl ndad r (29,32,33). Bu toksin komponentleri bir araya gelerek T-toksinlerin yap s na benzer por olu umu sa larlar. Ancak, T-toksinlerin aksine PVL nötrofilleri de lizise u rat r. PVL komponentleri tek ba lar na toksik de illerdir fakat bir arada intravenöz olarak verildiklerinde granülositoza sebep olmalar na ra men letal etki yapmazlar. Safla t r lm PVL komponentleri inhalasyon yoluyla fareye verildi inde letal nekrotik akci er infeksiyonuna yol açarlar (34). PVL, LukS-PV ve LukS-PV komponenetlerinin bir araya gelerek olu turduklar por olu turan bir heptamerdir ve polimorfonükleer lokositlerin (PMN) membranlar na hasar verir (Nekil-2).
ekil 2: PVL arac l kl doku nekrozu (8 numaral kaynaktan)
S .aureus’un di er por olu turan lokosidinlerinden farkl olarak, PVL hemolitik de idir.
LukS-PV PMN’lerin yüzeyindeki henüz tam tan mlanmam reseptörüne tutunur ard ndan LukF-PV ile dimer olu turur. LukS-LukF-PV ve LukF-LukF-PV’nin birbirine ba lanmalar heptamer olu turana kadar sürer. LukS-PV nin polimorfonükleer lökositlere ba lanmas yla LukS-PV protein kinaz (A veya C) taraf ndan fosforillenir ve Ca++ kanallar n n aktivasyonu gerçekle ir. Transdüksiyon sinyalinin indüklenmesi olas l kla interlokin ve inflamatuar mediatörlerin üretimini tetiklenmektedir (8).
PVL konsantrasyonuna ba l olarak PMN’ler lizis ile parçalanabilir veya hücre apoptoza gider. Yüksek PVL konsantrasyonu PMN’leri lizis ederken dü ük PVL konsantrasyonunda PVL do rudan mitokondri membran na ba lanarak PMN’ler apoptoza yöneltir (Nekil-3).
ekil 3: PVL’nin neden oldu u , PMN hücrelerindeki apoptoz ve doku nekrozu (8
numaral kaynaktan)
Safla t r lm PVL ile yap lan çal malarda, PVL’nin do rudan doku nekrozuna yol açmad görülmü tür. PVL’nin, doku nekrozu ve sepsis sonras PMN’lerden sal nan sitolitik hücre içeri i ile birlikte epitel hücreleri nekroza u ratt dü ünülmektedir. PVL arac l kl lizisin reaktif gronülositlerden oksijen ara ürünleri ve çe itli inflamatuar mediatörlerinin sal n m n indüklemesi bu dü ünceyi desteklemektedir (8).
PVL-pozitif CA-MRSA salg nlar , kapal ya ayan topluluklarda (hapisaneler, spor tak mlar , ordu ve homoseksüeller gibi) ve ayn zamanda sa l k personeli ve ailelerinde rapor edilmi tir (3). PVL-pozitif CA-MRSA su lar n n risk faktörlerinden ba ms z olarak genç insanlarda görülmesi kayg uyand rmaktad r (3,35). Son zamanlarda PVL üreten MRSA su lar hayvanlarda da rapor edilmi tir (3).
CA-MRSA su lar n n ilk ba larda hastane kökenli oldu u, hastenelerden topluma yay ld dü ünülmü tür (8). CA-MRSA’lar n hastane kökenli MRSA
(“Hopital-acquired” MRSA; HA-MRSA) izolatlar ndan genetik farkl l klar aç kland kça CA-MRSA’lar n farkl ve toplumda yayg n olan MSSA’lardan köken ald anla lm t r (8).
Tüm dünyada S. aureus su alr nda pvl geninin görülme s kl <% 5 iken yeni ortaya ç kan CA-MRSA su alr nda bu genin görülme s kl farkl çal malarda % 77 ila % 100 aras nda bildirilmi tir (36,37,38).
2.3.3.3. S. aureus’un epidemiyolojik özellikleri
CA-MRSA su lar n HA-MRSA su lar ndan ay ran üç temel genotipik fark bulunmaktad r. Bunlar; genetik kökenlerinin farkl olmas , metisilin direnci ta yan genetik elementlerinin yap sal farkl l klar ve CA-MRSA su lar n n pvl geni bulundurmalar d r (8).
HA-MRSA, genellikle büyük ve farkl direnç genlerini içeren Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) tipleri I,II veya III (34-67 kb) ta rken, CA-MRSA izolatlar yeni tan mlanan küçük SCCmec varyantlar n (SCCmec tip IV (24 kb) veya daha nadir görülen SCCmec V veya onun bir varyant olan VT) içerir. En büyük SCCmec elemanlar olan, tip II ve III V-laktam d antibiyotik direnç genlerini de içerir. Bu genler genellikle SCCmec IV ve V’te yoktur (8). SCCmec tip I,II,III içeren hastane kökenli metisiline dirençli Staphylococcus aureus (HA-MRSA) su lar na göre, (SCCmec) tip IV ve V içeren CA-MRSA su lar n n metisilin direnç genini di er S. aureus su lar na aktarmalar SCCmec tip IV ve V’in daha küçük olmas nedeniyle daha kolayd r (31).
MRSA’lar ile HA-MRSA’lar aras ndaki bir di er farkl l k CA-MRSA’larda pvl genlerini ta yan bakteriyofaj ]Sa2’nin CA-MRSA kromozomuna integre olmu ekilde bulunmas d r. pvl s kl kla SCCmec tip IV ta yan izolatlarda daha nadir olarak da SCCmec tip VT ta yan izolatlarda bulunmaktad r (8).
1970’lerde SCCmec tip IV toplum kökenli Staphylococcus epidermidis su alar nda da gösterilmi tir (8). S. aureus’ta SCCmec IV’ün tan mlamas ancak 1980’li y llarda yap lm t r. Bundan yola ç karak SCCmec tip IV’ün Staphylococcus
Multilokus dizi analizi tiplendirme (“multilocus sequence typing; MLST) ve “pulsed-field gel electrophoresis” (PFGE) yöntemleriyle CA-MRSA izolatlar n n, dünyada farkl co rafi bölgelerde yayg n bulunan predominanant HA-MRSA klonlar ndan farkl l klar tan mlanm t r (8,39,40,41). Farkl co rafi bölgelerde CA-MRSA izolatlar n n birbirinden farkl olduklar görülmü ve bununla beraber ayn co rafi bölgede de pek çok farkl genetik özellikteki CA-MRSA bulundu u saptanm t r (8).
ekil 4: Bugün geçerli olan CA-MRSA orijini (8 numaral kaynaktan)
Genetik özellikleri ve antibiyogram sonuçlar birbirinden farkl olsa da hemen hemen tüm toplum kökenli metisiline dirençli Staphylococcus aureus (CA-MRSA) su lar nda Panton-Valentin lokösidin (PVL) kodlayan virulans geni (pvl) bulunmaktad r.
CA-MRSA su lar n n PVL virulans faktörü ile sa l kl bireylerde aç k deri lezyonlar yapmas bu su lar n bireyden bireye temas yoluyla yay l m için bir avantaj sa lamaktad r (8).
2.3.3.4. Eksfoliatif Toksin
1971 y l nda bulunmu tur. Epidermolitik toksin ya da eksfoliyatin olarak da adland r l r. ‘Ha lanm Deri Sendromu’ na neden olmaktad r. Eksfoliatif toksinin A (ETA) ve B (ETB) olmak üzere iki tipi bulunmaktad r. Eksfoliatin A, 100°C’ye 20 dakika dayanabilmektedir. Eksfoliatin B ise 60°C’de 30 dakika s t l nca harap olur. Eksfoliatif toksin A geni kromozomal, eksfoliatif toksin B geni plazmid kökenlidir. Eksfoliatif toksinler, bakteri proteazlar grubundand r (27). ETA, hücre adezyon moleküllerinin katedrin ailesinin bir üyesi olan desmosomal protein olan desmoglein-1’i parçalayarak etki gösterir (15, 16, 26).
2.3.3.5. Enterotoksinler
S. aureus’un immünolojik olarak birbirinden farkl A, B, C (C1- C3), D, E ve F olarak
adland r lm sekiz enterotoksini bulunmaktad r. Enterotoksin F günümüzde Toksik Nok Sendrom Toksini-1 olarak adland r lmaktad r. Enterotoksinler, s ya dirençli olup 100°C’de 30 dakika dayanabilmektedir. Tek zincirli ve polipeptit yap dad r. Enterotoksin A ve D üreten su lar, besin zehirlenmelerine neden olurken, enterotoksin B üretenler genellikle hastane infeksiyonlar ndan sorumludur. Tüm enterotoksinler süperantijen niteli indedir (16,26).
2.3.3.6. Toksik Nok Sendromu Toksini-1 (TSST-1)
Bakteriyofaj kaynakl olan bu toksin, faj-1 grubundaki 29 ve 52 faj tipleri taraf ndan olu turulmaktad r (16).
S. aureus iki s n f süperantijen üretmektedir. Bunlar TSST ve stafilokokal
enterotoksinlerdir (SE). TSST, tst geni taraf ndan kodlan r, toksik ok sendromundan sorumludur. Süperantijenik uyar m sonucu sal nan sitokinlerin güçlü etkisi nedeniyle TSST, ok ve ölüme neden olmaktad r (Nekil 5). SE’ler ise g da zehirlenmelerine neden olurlar. G da zehirlenmeleri TSS gibi ölümcül de ildir ancak daha yayg n olarak görülür. SE, ent genleri taraf ndan kodlan r. G da üzerinde bakteriler taraf ndan üretilmi olan enterotoksin; g dan n yenmesi ile birlikte vücuda al n r ve midede kusma refleksini kontrol eden vagus sinir uçlar n uyar r. Nüpheli g dan n al nmas ndan üç-alt saat sonra ba layan projektil kusma ve kar n a r s S. aureus enterotoksinleri nedeni ile geli en g da zehirlenmesinin klasik belirtileridir. tst ve ent genleri bakteriyofaj kökenlidir (27).
2.4. Virulans Genlerinin Düzenlenmesi
S. aureus virulans genlerinin ço u, özellikle yüzey adezinlerini ve ekzoproteinleri
kodlayanlar, bir çevresel alg lama (‘quorum sensing’) sistemi taraf ndan düzenlenirler. Adezin genleri, üremenin erken safhalar nda eksprese edilir. Bakteri logaritmik üreme faz na girip bakteri say s çok artt nda adezin üretimi azal r ve ekzoprotein üretimi artar. Düzenleyici sistemin merkezi, agr genleridir. agr genleri, Agr A-D proteinlerini kodlarlar. Di er bir düzenleyici gen de
sarA’d r (27). sarA geni, gen promotorlar n n hemen üstündeki dizilere ba lanan SarA proteinini
kodlar. SarA, Agr yap m n uyar r. agr genlerinin ekspresyonu üreme faz na ba l d r. Logaritmik üreme faz nda bakteri Agr proteinlerini dü ük düzeyde üretir. AgrD sitoplazmik membran proteini olan AgrB taraf ndan salg lan r ve tiyolakton adl siklik peptidi meydana getirecek
ekilde kesilir. Bu peptit bir ‘oto indükleyici’ olarak görev yapar. Bu oto indükleyicinin yap s Gram negatif bakteriler taraf ndan üretilenlerden çok farkl d r ve hücre zar ndan kolayca difüze olmaz. Zardan geçebilmek için sitoplazmik zarda bulunan reseptörüne ba lanmak zorundad r. Tiyolaktonun etki gösterebilmesi için hücre zar nda bulunan bir sensör protein olan AgrC’ye ba lanmas gereklidir. Konsantrasyonu yeterince artt nda, tiyolakton AgrC’nin fosforile olmas na neden olur. Fosforillenmi AgrC ise, AgrA’y fosforiller. Fosforillenmi AgrA da RNA III ad verilen bir RNA molekülünün yap m n uyar r. RNA III, hücre yüzey adezinlerini kodlayan genlerin ekspresyonunu azalt rken, TSST, hemolizinler ve SEB gibi ekzotoksinleri kodlayan genlerin ekspresyonunu artt r r (27).
2.5. Patogenez ve Yapt 9 Hastal klar
S. aureus, do ada s k rastlanan bir bakteridir. .nsanda, burun delikleri, koltuk alt , vagina,
farinks, hasarl deri yüzeyi gibi vücudun de i ik bölümlerine kolonize olabilmektedir. .nfeksiyon, deri ve mukoza bütünlü ünün bozulmas n n ard ndan bakterinin dokuya ya da kana geçmesiyle ba lar (14,42). S. aureus, deri infeksiyonlar nda ya ve ter bezleri ile k l köklerini giri için kullanabilir. Genel olarak infeksiyon olu umunu etkileyen faktörler; insan savunma mekanizmalar , bakterinin say s ve virulans , deri ve mukoza bütünlü üdür (42).
Ya am tehdit edici boyutta olan stafilokok infeksiyonlar içinde, stafilokoksik bakteriyemi, endokardit ve sepsis bulunmaktad r. Bu tablolar infeksiyon için çe itli risk faktörleri bulunan ki ilerde daha s k olarak kar m za ç kmaktad r. S. aureus infeksiyonu geli me riskini artt ran ve
kona a ba l olan faktörler unlard r:
1 Konjenital ya da kazan lm lökosit kemotaksis defektleri 2 Hücre içi öldürme mekanizmalar ndaki sorunlar
3 Opsonizasyon defektleri 4 Deri yaralanmalar 5 Yabanc cisim varl 6 Virüs infeksiyonlar 7 Kronik hastal klar
8 Tedavi/ profilaktik amaçl antibiyotik kullan m
Stafilokok bakteriyemisi endokardit, metastatik infeksiyon veya sepsis sendromuna yol açabilmektedir (15,42). Stafilokok infeksiyonlar nda tipik patolojik bulgu, abse olu umudur.
Yaln zca potansiyel bir hedef olmas nedeniyle de il ayn zamanda aktivasyonu ile endovasküler hastal n ilerlemesine katk da bulunmas nedeni ile patojenik süreçte en önemli yap , endotel hücreleridir. Stafilokoklar endotel hücresine kolayl kla tutunarak adezyon-reseptör etkile imi ile ba lan r, ard ndan endotel hücreleri taraf ndan hücre içine al n rlar (20). Bunun ard ndan, bakteri kom u dokulara yay lmay ve kan dola m na girmeyi kolayla t ran proteolitik enzimler salar. Enfekte endotel hücresinin eksprese etti i doku faktörü, fibrin birikimi ve vejetasyon olu umunu kolayla t r r. Bakteri derin dokulara ula t nda, abse olu umuna yol açan inflamatuvar yan ta neden olur. Olaylar zinciri kardiyak endotelin etkilendi i endokardit patogenezinde oldu u gibi metastatik infeksiyon odaklar n n olu mas na da katk da bulunur. S.
aureus’un hücre içine girmesiyle, endotel hücreleri, Fc reseptörleriyle beraber çe itli adezyon
moleküllerini (vasküler hücre adezyon molekülleri ‘VCAM’ ve intersellüler adezyon molekülü ‘ICAM’) eksprese ederler ve interlökin (IL)-1, IL-6 ve IL-8 sal n m n sa larlar. Fc reseptörlerinin ekspresyonu immünoglobulin (Ig) veya immün kompleksler için bir ba lanma bölgesi olu turup bakteriyemi s ras nda bazen görülen vaskülit geli imine katk da bulunabilmektedir. Bakteri kökenli kemotaktik faktörlerin ve IL-8’in etkisiyle, nötrofil lökositler
infeksiyon bölgesinde diapedez ile gelip yukar da belirtilen adezyon moleküllerini eksprese eden endotel hücrelerine tutunurlar. Endotel hücrelerinin yap s ndaki de i iklikler plazma proteinlerinin transüdasyonuyla birlikte damar geçirgenli inin art na neden olur. Stafilokoklar ile temastan sonra hem doku makrofajlar hem de dola mdaki monositler IL-1, IL-6, IL-8 ve tümör nekroz faktörü T (TNF-T) salg larlar. T hücrelerinden interferon-b (IFN-b) sal n m ndan sonra makrofajlar aktive olurlar. Endotel hücreleri gibi monosit veya makrofajlardan kan dola m na sal nan sitokinler de sepsis sendromunun belirtilerine ve stafilokok hastal ile ili kili vaskülite katk da bulunurlar (43,44).
S. aureus süperantijenleri yüksek ate , ok, kapiller kaçak ve ço ul organ yetersizli iyle
karakterize olabilen ya am tehdit eden tablolara da yol açabilmektedir (25).
2.6. Stafilokoklar n Laboratuar Tan s
2.6.1. Gram Boyama ve mikroskobik inceleme
Klinik örneklerden haz rlanan Gram boyal preparatlarda, stafilokoklar 0.5-1.0 µm çapl Gram pozitif koklar olarak görülür. Tek tek, çiftler, k sa zincirler yada kümeler halinde görülebilir. Gram reaksiyonundaki de i imler inflamatuar hücreler ve onlar n hidrolitik enzimlerinin etkisi nedeniyledir (45).
2.6.2. Koloni Morfolojisi
Ço u stafilokok türleri 24 saatlik inkübasyonda 1-2 mm çapl koloniler olu tururlar. S.
aureus kolonileri sar -turuncu pigmentli, düzgün yüzeyli, hafif konveksdir. Di er su lar ise beyaz
gri koloniler olu tururlar. S. aureus ve di er KNS’ lerde pigment üretimi inkübasyon sonras nda oda s cakl nda bekletildi inde daha belirgin hale gelmektedir. Baz S. aureus ve baz KNS su lar nda opak koloniler ve effaf koloniler veya farkl beta-hemoliz zonlar bulunur. Beta-hemoliz inkübasyon uzat l rsa belirginle ir (45).
2.6.3. Katalaz Testi
Bu test Micrococcaceae ailesindeki katalaz enzimlerinin varl n saptar. Lam üzerine %3 hidrojen peroksit damlat larak yap l r. Hemen olu an kabarc klar hidrojen peroksitin su ve oksijen gaz na dönü ümünün göstergesidir (45).
2.6.4. S. aureus’u di er stafilokoklardan ay ran yöntemler 2.6.4.1. Lam Koagülaz Testi
Bu test için kanl agar, CNA agar veya di er selektif olmayan besiyerlerinde üremi koloniler kullan l r. Lam üzerine bir damla distile su damlat l r. Stafilokok kolonileri su ile kar t r larak homojen süspansiyon elde edilir. Üzerine bir damla plazma damlat l r ve elde çevrilerek kar t r l r. On saniye içinde S. aureus’un birbirine yap mas ndan kaynaklanan gözle görülen kümele menin oldu u gözlenirse test pozitiftir. Lam koagülaz testi S. aureus duvar ndaki ‘clumping factor’ün varl n gösterir. Otoaglütinasyona neden oldu u için yüksek tuz içeren besiyerlerinde üremi koloniler kullan lmaz. E er lam koagülaz negatif ise tüp koagülaz testi yap lmal d r. S. aureus d nda, Staphylococcus lugdunensis ve Staphylococcus schleiferi’nin de lam koagülaz testinde pozitif sonuç verebilmektedir (16).
2.6.4.2. Tüp Koagülaz Testi
Hücre d na sal nan koagülaz gösterir. Serum fizyolojik ile 1/5 oran nda suland r lm plazma içinde stafilokok kolonisi ezilip kar t r l r. Saat ba kontrol edilmek suretiyle 35°C’de dört saat p ht n n olu mas için bekletilir. P ht n n olu mas pozitif sonuç olarak de erlendirilir. Negatif olan testler oda s cakl nda 18-24 saat bekletilir. Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus delphini türlerinin de tüp koagülaz testi pozitiftir (16).
2.6.4.3. Mannitol Hidrolizi
Bu test için mannitollu tuzlu agar kullan l r. Bu besiyerinde üretilen S. aureus kolonilerinin etraf nda 48 saatte sar zon, S.epidermidis kolonilerinin etraf nda k rm z zon olu tu u gözlenir.
S. aureus, mannitolü fermente ederek, besiyerinin içerdi i fenol k rm z s ay rac n n rengini
sar ya çevirir (16).
2.6.4.4. Protein A Saptanmas
Protein A saptama yöntemi, lam koagülaz testine bir alternatiftir. Protein A, IgG’nin Fc kolu için spesifik afiniteye sahiptir. Protein A’y saptamak için ticari olarak bulunan insan
fibrinojen ve IgG’si ile kapl polistren lateks partikülleri içeren ay raçtan reaksiyon kart na bir damla damlat l r. Stafilokok kolonisi tahta uygulama çubu u ile kar t r l r ve kart 20 saniye çevrilir, aglütinasyon gözlemlenir. Aglütinasyonun meydana gelmesi pozitif sonuç olarak de erlendirilir. Negatif olan testlerde herhangi bir de i im olmaz. S. aureus, protein A testi pozitif, Staphylococcus epidermidis ise negatif sonuç verir (16).
2.6.4.5. H zl Termonükleaz Testi:
Bir mililitre Beyin Kalp .nfüzyon (BK.) s v besiyeri içerisine birkaç stafilokok kolonisi aktar l r. 35°C’de iki saat inkübe edilir. Su banyosunda 15 dakika süspansiyon kaynat l r, oda s cakl na so utulur. DNase test agar üzerinde pipet yard m yla aç lan oyuklara iki damla so utulan organizma süspansiyonu eklenir. Bir-iki saat 35°C’de inkübe edilir. Kuyucuklar etraf nda pembe yada k rm z hale görülmesi (pozitif reaksiyon) izlenir. S. aureus, termonükleaz testi pozitiftir (16).
2.7. Stafilokok nfeksiyonlar n n Tedavisinde Kullan labilen Antibiyotikler
Stafilokok infeksiyonlar n n tedavisinde seçilecek uygun antibiyotik, bakteriyi öldürerek yay l m n engellemelidir (14). Bu amaçla kullan labilecek antibiyotikler;
1 Hücre duvar sentez inhibitörleri 2 Protein sentez inhibitörleri
3 Nükleik asit sentezi inhibitörleri olmak üzere üç grupta incelenebilir.
Bu grup antibiyotiklerden en uygun olan , antibiyotik duyarl l k testleri ile belirlenmeli ard ndan antibiyoterapiye ba lanmal d r. Genellikle kültür ve antibiyogram sonucu beklenmeden, kültür için örnek al n r al nmaz empirik tedaviye ba lan r. Empirik tedavide uygulanan antibiyotik, kültür ve antibiyogram sonucuna göre de i tirilir.
2.7.1. Hücre Duvar Sentez .nhibitörleri 2.7.1.1. Beta-laktam Antibiyotikler
Kimyasal yap lar nda ortak bir beta-laktam halkas ta yan geni bir antibiyotik grubudur. Bu antibiyotikler, hücre duvar sentezinin transpeptidasyon a amas nda görev alan transpeptidaz
ve karboksipeptidaz enzimlerine ba lan p peptidoglikan sentezini inhibe ederler. Bu nedenle bu enzimlere penisilin ba layan proteinler (PBP) de denilmektedir.
Beta laktam antibiyotikler beta-laktam halkas na ba l yan zincirler ve di er halkalara göre; penisilinler, sefalosporinler, monobaktamlar, karbapenemler ve beta laktamaz inhibitörleri olmak üzere be temel s n fa ayr l rlar (46,47).
2.7.1.1.1. Penisilinler
Tiazolidin halkas na bir beta-laktam halkas n n eklenmesiyle olu an 6-aminopenisilanik asit çekirde i ta yan antibakteriyel ajanlard r. Bakterisidal etkilidirler. Bu grup antibiyotikler, do al penisilinler, penisilinaza dayan kl semisentetik penisilinler, aminopenisilinler, karboksipenisilinler, üreidopenisilinler olarak s n fland r l rlar. Penisilin G (benzil penisilin) bilinen en önemli do al penisilindir. Benzil yan zincirinin 6-aminopenisilanik asit çekirde ine eklenmesiyle olu mu tur. Penisilin G, laktamazlar ile inaktive olur. Penisilin G’nin beta-laktamazlara inaktivasyonu yan zincirlere metil veya etil gruplar içeren büyük aromatik halkalar n eklenmesi (metisilin, nafsilin, oksasilin) ile önlenmi tir. Bu antibiyotikler, penisilinazlara dirençli penisilinler olarak adland r l rlar (46,47).
2.7.1.1.2. Sefalosporinler
Bir beta-laktam halkas ile dihidrotiozin halkas n n birle mesinden olu mu 7- aminosefalosporanik asit çekirde i içerir. Sefalosporinler, etki spektrumlar ndaki geni lemeye paralel olarak 1.- 4.ku ak sefalosporinler eklinde adland r lmaktad r. Bu antibiyotikler bakterisidal etkilidirler. Ancak tüm beta-laktamlar gibi metisiline dirençli S. aureus ve
S.epidermidis izolatlar na kar etkisizdirler. Birinci ku ak sefalosporinler, Gram pozitif
bakterilere kar iyi, Gram negatif bakterilere kar orta derecede etkilidirler. .kinci, üçüncü ve dördüncü ku ak sefalosporinlere do ru gidildikçe ilac n Gram negatif bakterilere olan etkinli i artmakta, Gram pozitif bakterilere kar olan etkinli i azalmaktad r (46). Son y llarda geli tirilmi ve Faz 3 a amas nda olan seftobiprol ise, PBP 2a’ya ve pnomokoklardaki PBP 2x’e ba lanabilmesi nedeniyle MRSA izolatlar na ve penisilin dirençli pnomokoklara etkilidir.
2.7.1.1.3. Karbapenemler
sülfür veya oksijen atomlar yerine hidroksietil yan zincirleri bulunmaktad r. Genellikle beta-laktamazlara dirençlidirler. Ancak metisiline dirençli stafilokoklar, dü ük afiniteli PBP yap m nedeniyle karbapenemlere de dirençlidirler (46).
2.7.1.2. Glikopeptit Antibiyotikler
Bakteri hücre duvar nda peptidoglikan sentezi s ras nda pentapeptit yan zincirlerinde bulunan D-alanil-D-alanin dipeptidi ile birle erek peptidoglikan sentezini inhibe ederler. Glikopeptitler (vankomisin ve teikoplanin) metisiline dirençli S. aureus ve KNS’lerin yol açt infeksiyonlar n tedavisinde ilk seçenek olarak kar m za ç kmaktad r (46).
2.7.2. Protein Sentez .nhibitörleri
Pek çok antibiyotik, insanlarda bulunmayan bakteriyel 30S ve 50S ribozom alt birimlerine etki ederek insan hücrelerindeki protein sentezine zarar vermeden bakteriyel protein sentezini inhibe edebilmektedir.
2.7.2.1. Aminoglikozidler
Bir aminosiklitol halkas na amino ekerlerin glikozidik ba larla ba lanmas ile olu urlar. Streptomisin, neomisin, kanamisin, tobramisin ve gentamisin do al olarak elde edilen aminoglikozidlerdir. Aminoglikozidler, bakterinin 30S ribozomal alt ünitesine geri dönü ümsüz olarak ba lan r. Stafilokoklara etkili olduklar halde beta-laktamlar veya glikopeptitlerle kombine edilerek kullan lmalar önerilmektedir (47).
2.7.2.2. Makrolidler
Makrolidler, 50S ribozom alt ünitesine ba lanarak peptit zincirinin uzamas n önler. Bakteriyostatik etkileri vard r. Grubun prototipi eritromisindir (47).
2.7.2.3. Oksazolidinonlar (Linezoid)
Bu antibiyotik, N-formylmethionyl tRNA- mRNA- 30S üçlü kompleksini etkileyerek, protein sentezini bozar. Bakteriyostatik etkilidir. Linezoid, özellikle metisiline dirençli S. aureus yan s ra penisiline dirençli Streptococcus pneumoniae ve vankomisine dirençli Enterococcus
2.7.2.4. Streptograminler
Bu antibiyotikler, 50S ribozomal alt üniteye ba lanarak etkisini gösterir. Özellikle dirençli Gram pozitif bakteri infeksiyonlar nda etkilidir. Kimyasal olarak streptogramin A ve B olmak üzere iki gruba ayr l r. Bu iki grup birbirleriyle sinerjik etkilidir (22).
2.7.2.5. Linkozamidler
Bakteriyel 50S ribozom alt ünitesine ba lan r, peptit zincirinin uzamas n engeller. Bu grup antibiyotiklerden özellikle klindamisin, metisiline duyarl stafilokok infeksiyonlar nda etkili olmaktad r (47,48).
2.7.2.6. Kloramfenikol
50S ribozomal alt üniteye ba lan r. Yeni peptit ba lar n n sentezini önler. SCCmec içerisindeki ek direnç genlerine ba l olarak metisiline dirençli S. aureus su lar na etkili de ildir (43). Kloramfenikol insan hücrelerinde bulunan 60S ribozomal alt üniteyi etkilememesine ra men insan hücrelerindeki mitokondrilerde 50S alt ünite bulundu u için, mitokondrilerdeki protein sentezini inhibe ederek kemik ili inde doza ba ml toksik etkiler ortaya ç kabilece inden klinik kullan m k s tl d r (46,47).
2.7.3. Nükleik Asit Sentezi .nhibitörleri 2.7.3.1. Sülfonamidler ve Trimetoprim
Sulfonamidler, yap sal olarak benzedikleri paraaminobenzoik asit (PABA) ile yar arak dihidrofolat sentezini inhibe ederler. Trimetoprim ise dihidrofolat redüktaz inhibe ederek dihidrofolattan tetrahidrofolat sentezini engeller. Sonuçta bakteriyel DNA sentezi engellenir. Trimetoprim-sulfametoksazol (SXT) kombinasyonu MRSA su lar da dahil olmak üzere pek çok Gram pozitif kok ve Gram negatif basile etkilidir ancak bakteriyostatik olmas nedeniyle ya am tehdit eden infeksiyonlar n tedavisinde uygulanmaz (49,50).
2.7.3.2. Kinolonlar
Çift halkal kinolon çekirde i içeren antibiyotiklerdir. Kinolon çekirde ine flor atomunun eklenmesiyle florokinolonlar türetilmi tir. Bakterisidal etkilidirler. Bakterilerde DNA’n n süper
sarmal n n olu mas ve replikasyon s ras nda DNA iplikçiklerinin aç lmas için gerekli olan DNA giraz ve topoizomeraz IV enzimlerini inhibe ederler. S. aureus ve KNS’lerde iyi derecede etkilidirler (49).
2.7.3.3. Rifampin
Bakterisidal etkili bir antibiyotik olan rifampin bakteriyel DNA’ya ba ml RNA polimeraz enzimi ile stabil bir kompleks olu turup bakteriyel RNA sentezini önler. Stafilokok infeksiyonlar nda tek ba na kullan ld nda h zla direnç geli imi gözlenir. Metisilin ve glikopeptid dirençli stafilokok infeksiyonlar nda di er antibiyotiklerle kombine olarak kullan labilmektedir (49).
2.8. Stafilokoklarda metisilin direnci ve epidemiyolojisi
Direnç, bir mikroorganizman n antimikrobiyal ajan n öldürücü veya üremeyi engelleyici etkisinden korunabilme kapasitesidir (51).
Antibiyotik ça n n ba lang c ndan beri antibiyotik kullan m n n olu turdu u seçici bask stafilokoklarda çok k sa sürede direnç geli mesine yol açm t r (52). Bu durum 1941’de penisilin G’nin tedaviye girmesi ile beta-laktamaz üretimine ba l direnç geli mesi ile ba lam , bundan sonra da her kullan ma giren antibiyoti e kar direnç geli imi ile sürmü tür. Epidemik klonlar, henüz 1950’li y llarda biribiri ard na penisilin G, streptomisin, kloramfenikol, oksitetrasiklin ve daha sonra da makrolidlere direnç kazanm t r (53).
Çoklu dirençli S. aureus su lar n n o y llardaki en önemli temsilcisi 80/81 (faj tipi) olarak adland r lan izolatlard r. Bu izolatlar günümüzde kullan lan MLST (“multilocus sequence typing”) tekni i ile ST30 klonunda yer almaktad r. Bu izolatlar n bir k sm n n Panton-Valentin Lökosidini (PVL) üretti i de gösterilmi tir. 80/81 klonu hastaneler ve toplumda yay lm ve özellikle deri ve derin yumu ak doku infeksiyonlar na yol açm t r. S. aureus 80/81 1950’lerde tüm dünyaya yay lm t r. 1959 y l nda metisilinin tedaviye girmesi ile bu klonun izolasyon s kl nda dü me olmu tur fakat, son y llarda 80/81 klonu özellikle Avrupa ülkelerinde toplum kökenli MRSA olarak tekrar kar m za ç km t r (54).
.lk MRSA olgular metisilinin kullan ma girmesinden iki y l sonra 1961 y l nda .ngiltere’de bildirilmi tir. O zamandan günümüze MRSA klonlar tüm dünyada bu arada ülkemizde de
yay lm t r. Ülkemizden 11 laboratuvar n kat ld ve Akdeniz ülkelerinde antibiyotik direncini izlemeyi hedefleyen ARMed çal mas na göre kan kültürlerinden izole edilen S .aureus izolatlar aras nda MRSA oran 2003, 2004 ve 2005 y llar için s ras ile %43, %40 ve %35’dir (55). Farkl laboratuvarlara göre oranlar %21 ile %70 aras nda de i mektedir (Armed raporu www.earss.rivm.nl) .zolatlar n %35’i çoklu dirençlidir (>3 antibiyoti e dirençli) ve bu oran ARMed’e kat lan ülkeler aras nda en yükse idir. SENTRY çal mas nda da ülkemiz için MRSA oran %30.9 olarak bildirilmi tir (56). MRSA izolatlar n n prevalans özellikle yo un bak m ünitelerinde % 80’ni geçmi tir (%84) (34). Dünyadaki oranlar da farkl de ilidir. SENTRY sürveyans program nda 1997-1999 y llar aras ndaki MRSA prevalans n n Avustralya için %22.4, Japonya için %66,8, Latin Amerika ülkeleri için %34.9, ABD için %32.4 ve Avrupa ülkeleri için %26.5 oldu u görülmü tür (57,58).
Avrupa’da MRSA prevalans ülkeler aras nda de i mektedir. Kuzey Avrupa ülkeleri ve Hollanda’da prevalans %1-2 iken, do u ve güneye inildikçe prevalans artmaktad r (EARSS 13)
2.9. Staphylococcus casette chromosome mec (SCC mec)
Staphylococcus casette chromosome mec (SCC mec), stafilokok türleri aras nda genetik madde al veri ine arac l k eden hareketli elemanlard r. SCC elemanlar , de i ik KNS türlerinde ve metisiline duyarl S. aureus izolatlar nda da bulunmaktad r. S. aureus’da metisilin direncinden sorumlu olan mecA geni de SCCmec ad verilen ve SCC ailesinin metisilin direnci aç s ndan özelle mi bir üyesinde bulunmaktad r. SCCmec, bakteriyofajlar, transpozonlar, konjugatif transpozonlar veya integre olabilen plazmidler gibi bilinen di er hareketli genetik elemanlardan farkl d r. Genomik bir ada olarak görülebilse de S. aureus ‘un virulans ile ili kili hiçbir gen içermedi i için patojenite adalar ndan farkl d r (59,60).
S. aureus’ taki metisilin direnci mecA geni taraf ndan kodlan r. mec A varl “Dü ük
afiniteli penisilin ba layan protein-2a” üretimi anlam na gelir. Yukar da da belirtildi i gibi, mecA geni SCCmec içinde yer almaktad r. Nimdiye kadar MRSA’larda alt farkl SCCmec tipi tan mlanm t r (2,61). SCCmec tiplendirmesi, hastane kökenli MRSA’larla (HA-MRSA) toplum kökenli MRSA’lar n (CA-MRSA) birbirlerinden farkl olduklar n kan tlar. Tüm dünyada izole edilen SCCmec tip I, II ve III en çok HA-MRSA su lar nda, tip IV ve V ço unlukla CA-MRSA su lar nda bulunmaktad r (2). SCCmec tip IV izolatlar genellikle, deri ve yumu ak doku infeksiyonlar , abseler ve ameliyat sonras infeksiyonlardan izole edilirken SCCmec tip II su lar
