Genetik Bulgular

Tablo 3: Gruplara ait (n=8) bcl-2, bax, caspase-3 ve Nox-2 gen

ekspresyon seviyeleri % aktin cinsinden verilmiştir. a _{p<0.001 kontrol grubu} ile karşılaştırıldığında, b _{p<0.001 dox grubu ile karşılaştırıldığında} c _p<0.05 dox grubu ile karşılaştırıldığında,

Kontrol Dox Dox+Nec-1 Nec-1

Bcl-2 26,73±2,35 18,75±1,08a _24,05±1,75b _26,38±2,29

Bax 9,78±4,38 48,62±28,18a _25,50±5,68c _11,91±3,52

Caspase-3 23,37±1,44 65,42±9,01a _33,68±9,48b _23,91±2,28

Şekil 26: bcl-2, bax, casp-3, Nox-2 genlerinin (%aktin cinsinden) ekspresyon seviyeleri (n=8)

Real Time PCR analizinin gruplar arası sonuçları tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve post hoc Tukey testi kullanılarak yapıldığında bcl-2 geninin β-actin genine göre ekspresyon seviyeleri karşılaştırıldığında; Dox grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak azaldığı (p<0.001), Dox grubundaki azalmanın ise Dox+Nec-1 grubunda ise, anlamlı olarak arttığı görüldü (p<0.001) . Tek başına Nec-1 verilen grupta ise kontrol grubuna göre anlamlı bir fark gözlenmedi.

Bax geninin ekspresyon seviyeleri gruplar arasında karşılaştırıldığında; Dox grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttığı (p<0.001), Dox grubundaki artışın Dox+Nec-1 grubunda anlamlı olarak azaldığı görüldü (p<0.05). Tek başına Nec-1 verilen grupta ise kontrol grubuna göre anlamlı bir fark gözlenmedi.

Casp-3 ve Nox-2 genlerinin ekspresyon seviyeleri gruplar arasında karşılaştırıldığında; Dox grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttığı (p<0.001), Dox grubundaki artışın Dox+Nec-1 grubunda anlamlı olarak azaldığı görüldü (p<0.001). Tek başına Nec-1 verilen grupta ise kontrol grubuna göre anlamlı bir fark gözlenmedi.

5.TARTIŞMA

Birçok kanser türünün tedavisinde kullanılan güçlü etkili doksorubisinin en önemli ve ciddi yan etkisi kardiotoksisitedir (55). Kardiotoksik etkilerin araştırılmasında çalışmalar doksorubisin yapısında bulunan tetrasiklik halka yapısındaki kinon ve hidrokinon kromofor grupları üzerinde yoğunlaşmıştır. Yapısında bulunan kinon halkası, sitokrom P450 redüktaz ve ksantin oksidaz enzimleri tarafından semikinon radikaline indirgenir (59,95). Bunlar, oksijen molekülünü indirgeyerek O2- ve H2O2 oluştururlar. Artan oksidatif stres lipid peroksidasyonuna ve nihayetinde hücre hasarına neden olur (71).

Çalışmamızda izole perfüze kalpte ölçülen KAH, PB, LVDP, LV(dP/dt)max, LV(dP/dt)min gibi kardiyak fonksiyonun göstergelerine bakıldığında Dox verilen grupta kontrol grubuna göre PB’nın istatistiksel olarak anlamlı şekilde arttığı ve KAH, LVDP, LV(dP/dt)max, LV(dP/dt)min değerlerinin ise anlamlı olarak azaldığı görüldü. Bu bulgular doksorubisinin kardiyak fonksiyonları bozduğuna işaret etmekte ve doksorubisine bağlı bildirilen kardiomiyopati ile uyumluluk göstermektedir (57). Histopatolojik incelemeler sonucunda kontrol grubundan farklı olarak, Dox grubunda kas liflerinde tekli veya gruplar şeklinde vakuolümsü yapılar ve yaygın hemorajiler, bazı kesitlerde ise fokal ödemin yanısıra kas liflerinde hyalinizasyon ve fibrozis gözlendi. Bu bulgular daha önce yapılan çalışmalarda bildirilen doksorubisine bağlı olarak miyokardiumda oluşan hücresel lezyonlar, fibrozis, yaygın hemorajiler şeklindeki dejeneratif değişikliklerle uyumludur (97). Bu histopatolojik bulgular doksorubisine bağlı gelişen hasarı gösterirken farmakolojik olarak ortaya konan kardiotoksisite tablosunu da desteklemektedir. Doksorubisin grubunda kalp dokusunda ölçülen MDA düzeylerinin kontrol grubuna göre artması doksorobisin ile indüklenen serbest radikallere bağlı oluşan doku hasarını ortaya koymaktadır. Benzer şekilde yapılan çalışmalarda da doksorubisin ile serbest oksijen radikallerinin ve MDA değerinin arttığı bildirilmiştir (61,57).

Doksorubisine bağlı olarak artış gösteren serbest radikaller bir yandan direkt doku hasarına sebep olurken diğer yandan apoptotik sinyallerin aktivasyonuna ve sonuçta doksorubisin kardiotoksisitesinde önemli rolü olan kardiyomiyositlerin apoptozisine yol açar (85). Doksorubisinin oluşturduğu apoptozis ekstrinsik ve intrinsik yolakların her ikisini de içerir (86). İntrinsik yolakta apoptotik uyarı alınmasından sonra aktifleşen bax proteini bcl-2 proteinini inaktifleştirir (15). Bax, mitokondri zar potansiyelini değiştirir ve MPTP’den sit-c salınır. Salınan sit-c casp-3’ü aktive eder ve apoptozis gerçekleşir (20). Ekstrinsik yolakta ise doksorubisin doğrudan casp-3’ü aktive eder ve apoptozis gerçekleşir (22). Apoptozis yolağının aktivitesi proapoptotik genlerin ekspresyon seviyelerinde artışa neden olurken antiapoptotik gen ekspresyon seviyelerinde ise azalmaya neden olur. Ayrıca redükte NADPH'ın, Nox2 tarafından okside edildiği reaksiyonda oksijen, superoksit iyonuna indirgenir (81). Nox2 ROS'ların üretimine katkıda bulunur ve sit-c, AIF salınımını artırarak apoptozisi indükler.

Yapılan çalışmalarda; invivo olarak doksorubisin alımı ile casp-3 aktivasyonunun apoptozis ile ilişkili olduğu (87), farmakolojik ya da genetik olarak bax inhibisyonunun kardiyak, hepatik ve serebral I/R’ye bağlı olarak infarkt alanı azalttığı gösterilmiştir (98,99).

Miyokardiyal I/R modelli birçok çalışmada kaspaz inhibitörleri kullanılmış ve etkileri araştırılmıştır. Ruetten ve arkadaşlarının casp-3/7 inhibitörleri kullanarak yaptıkları I/R çalışmasında ratlarda infarkt alanının ve casp-3 aktivitesinin azaldığı, benzer şekilde Chapman ve arkadaşlarının tavşanlarda yaptıkları I/R çalışmasında da casp-3 inhibitörlerinin infark alanını azalttığı gösterilmiştir (100,101). Yapılan bir çalışmada, doksorubisin ve NADPH'ın enzimatik aktivite yokluğunda O2- oluşturduğu bildirilirken (102) bir başka çalışmada 30 dakika iskemi sonrası 24 saat reperfüzyon yapılan Nox1 ve Nox2 negatif olan farelerde miyokardiyal hasarın anlamlı bir şekilde azaldığı (103), bir diğer çalışmada Nox2 negatif olan ratlarda doksorubisinin oluşturduğu kardiyak superoksit miktarının azaldığı bildirilmiştir (104).

Tavşan kalbinde Langendorf ile yapılan bir I/R çalışmasında ise antiapoptotik protein olan bcl-2 düzeyi 20, 25 ve 30 dakika iskemi sonrasında kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalırken, proapoptotik protein olan bax ve casp-3 düzeylerinin ise anlamlı olarak arttığı gösterilmiştir (105).

Literatür bilgileri ile uyumlu olarak çalışmamızda Dox grubunda bcl-2 gen ekspresyon seviyesinin kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalması, antiapoptotik aktivitenin baskılandığını gösterirken, Bax, casp-3, Nox2 genlerinin ekspresyon seviyelerinin artması ise apoptozis indüksiyonuna işaret etmektedir.

Apoptozisten farklı olarak kaspazlardan bağımsız olan nekroptozis, moleküler düzeyde TNFR1 gibi ölüm reseptörlerinin uyarılmasına bağlı RIPK1/RIPK3/MLKL nekroptozom kompleksinin oluşumu sonucu meydana gelmektedir (89). TNFR1 ile tetiklenen bu yolun başlangıcındaki bir kısım sinyal molekülleri hem apoptozis hem de nekroptozis yolağı için ortak olmakla beraber hangi yolun işleyeceği bazı regülatör moleküllerin düzeyi ile ve kaspaz inhibisyonu varlığında belirlenmektedir. Kaspaz 8’in inhibisyonu ve cIAPs deplesyonu durumunda apoptozis baskılanırken nekroptozis aktive olur (89,96).

Çalışmamızda doksorubisin kardiotoksisitesi üzerine etkisinin araştırıldığı Nec-1, RIP1’in kinaz aktivitesini inhibe ederek etki gösterir (90). Kalp dokusunda ölçülen MDA düzeylerinin Dox+Nec-1 grubunda Dox grubuna göre anlamlı olarak azalması ve bunun yanısıra perfüze edilen izole kalplerde Dox+Nec-1 grubunda Dox grubuna göre perfüzyon basıncı değerlerinin anlamlı şekilde azalması, KAH, LVDP, LV(dP/dt)max ve LV(dP/dt)min değerlerinin ise anlamlı olarak artması doksorubisinin oluşturduğu kardiomiyopati belirtilerinin Nec-1 ile düzeldiğini göstermektedir.

Dox+Nec-1 grubunda yapılan histopatolojik incelemeler sonucu miyokard kesitlerinde normale yakın histolojik görünüm izlenmesi Nec-1’in doksorubisinin oluşturduğu miyokardial hasar üzerinde önemli derecede koruyucu etkili olduğunu göstermektedir.

Bu bulgular doksorubisin kardiotoksisitesinde nekroptozisin de rolü olabileceğini göstermektedir. Doksorubisin kardiyotoksisitesinde nekroptozisin rolünü gösteren şimdiye kadar yapılmış bir çalışma bulunmamakla beraber kardiyak I/R modelinde Nec-1’in koruyucu etkileri bildirilmiştir (106). İnvivo olarak yapılan pek çok çalışmada iskemik beyin hasarında ve miyokardiyal infarktüste Nec-1'in koruyucu etkileri gösterilmiştir (106,107). Degterev ve ark. travmatik beyin hasarı modellerinde yaptıkları çalışmada Nec-1'in beyin hasarını azalttığını ve serebral fonksiyonları düzelttiğini bildirmişlerdir (108).

Smith ve ark.’nın izole rat ventriküler miyositlerinde in-vitro 100µM Nec-1 kullanarak yaptıkları çalışmada ROS üretimine bağlı olarak Nec-1'in MPTP'nin açılımını geciktirdiği, Langendorf sisteminin kullanıldığı aynı çalışmada, farelerde yapılan I/R modelinde Nec-1'in miyokardiyal hasarı önlediği ve oksidatif stres altında Nec-1'in nekrotik hücre ölümünü azalttığı tespit edilmiştir (107). Bir diğer çalışmada ise oksidatif strese maruz kalan

ratlar incelendiğinde, rat kardiyomiyositlerinde Nec-1'in MPTP açılma süresini uzattığı görülmüştür (109).

Nekroptozis yolunda RIPK1/RIPK3/MLKL kompleksinin meydana getirdiği hücre hasarının yanısıra RIPK3’ün farklı sinyallerle mitokondride ROS üretimini indüklediği bilinmektedir (34).

Çalışmamızda Dox+Nec-1 grubunda bcl-2 gen ekspresyon seviyesinin Nec-1’in etkisi ile Dox grubuna göre anlamlı olarak arttığı, Bax, casp-3 ve Nox2’nin gen ekspresyon seviyelerinin ise anlamlı olarak azaldığı görüldü. Bu bulgular Nec-1’in doksorubisin kardiotoksisistesi üzerine koruyucu etkilerinin sadece nekroptozis üzerinden olmayıp apoptotik ve proapoptotik genlerin ekspresyonunu baskılarken antiapoptotik genlerin ekspresyonunu artırmak sureti ile apoptozis üzerinden de ortaya çıktığını göstermektedir. Bu etkinin nasıl oluştuğu bilinmemekle beraber Nec-1’in apoptozis yolunda önemli rolü olduğu bilinen mitokondriyal ROS üretimini azaltarak mitokondri kaynaklı apoptoziste yer alan MPTP kanalları üzerindeki etki ile ve bunun yanısıra doksorubisin kardiotoksisitesinde ve apoptoziste bir başka ROS

kaynağı olan NADPH oksidaz gen ekspresyonundaki azalmaya bağlı olabileceği düşünülmektedir.