Um total de 59 isolados fúngicos foi obtido dos tecidos sadios de Melia azedarach. Estes isolados foram agrupados em 18 espécies, sendo uma delas pertencente à classe Coelomycetes1 e 17 Hyphomycetes2. Foram identificados oito gêneros, entre eles um Ascomycetes3 (Balansia sp) e um Basidiomycetes4 (ainda não identificado em nível de gênero e espécie). Este total de isolados fúngicos não incluem os fungos Mycelia sterilia. Vale ressaltar que nenhum procedimento para induzir a esporulação foi realizado e como conseqüência, alguns fungos que não apresentaram as suas estruturas de reprodução não foram considerados. A distribuição dos fungos endofíticos nos tecidos sadios de M. azedarach encontra-se na Tabela 2.2.
Os fungos isolados dos tecidos sadios de M. azedarach foram identificados no laboratório do Instituto de Ciências Biológicas do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal do Amazonas, pela pesquisadora Profa. Dra. Maria Francisca Simas Teixeira, embora alguns ainda permaneçam sem identificação. Alguns gêneros de fungos foram identificados no nosso laboratório.
Mais do que uma espécie endofítica foi isolada do mesmo tecido, corroborando com os estudos similares com outros hospedeiros na qual foi encontrada uma grande variedade de espécies fúngicas decorrentes de uma única espécie hospedeira (PETRINI et al., 1992). Essas evidências sugerem que os grupos endofíticos estão distribuídos especificamente em cada tecido ou órgão como apresenta a Tabela 2.2. Estas diferenças poderiam ser refletidas na preferência dos fungos pelos tecidos do hospedeiro, conforme PETRINI et al. (1992), que concluíram em seus estudos que diferentes tecidos de plantas e órgãos podem exibir microhabitats distintos. TAYLOR et al. (1999) confirmou esta hipótese, verificando que cada tecido de uma espécie hospedeira poderia funcionar como ecossistemas distintos. Além disso,
1
COELOMYCETES: Fungos mitospóricos com conidioma (ALEXOPOULOS et al., 1996).
2
HYPHOMYCETES: Fungos mitospóricos que contém os conidióforos livres sobre o micélio, isto é, não produzem conidioma (ALEXOPOULOS et al., 1996).
3
geralmente um e na maioria das vezes, poucas espécies dominam a comunidade fúngica (PETRINI et al., 1992).
A maioria dos fungos isolados dos tecidos sadios de M. azedarach foram pertencentes a classe Hyphomycetes. Os gêneros mais comuns encontrados foram Aspergillus e Penicillium (Figuras 2.8 e 2.9). Estes fungos são cosmopolitas e geralmente epifíticos, mas também podem ocorrer endofiticamente (SCHULTHESS e FAETH, 1998).
Espécies endofíticas de Balansia são conhecidas como produtoras de metabólitos secundários (alcalóides), os quais protegem suas plantas hospedeiras do ataque por herbívoros (REDDY et al., 1996). Espécies de Fusarium e Trichoderma foram registrados apenas nos fragmentos provenientes do córtex das raízes (Tabela 2.2, Figura 2.3). Os fungos do gênero Fusarium são de particular importância do ponto de vista fitopatológico por serem patógenos de plantações. Fusarium moniliforme é um parasita não obrigatório do milho (Zea mays L.) e existe uma série de doenças do milho que são resultantes da infeção por F. moniliforme, incluindo a podridão das sementes e raízes e produção de micotoxinas (BACON e HINTON, 1996). Como visto anteriormente no capítulo 1, um fungo fitopatogênico poder ser modificado através de mutação e então crescer como um endófito não patogênico (FREEMAN e RODRIGUÉZ, 1993) e a infecção, portanto, nem sempre resulta no aparecimento da doença. A incapacidade em manifestar uma doença pode ser reflexa da seletividade da planta contra a enfermidade, da detoxificação de fitoalexinas pelos fungos, e/ou uma interação de desses fatores mencionados acima com condições ambientais adequadas, freqüentemente ocorrendo posteriormente na vida da planta (BACON e HINTON, 1996).
A forma de reprodução dos fungos ocorre nos modos assexuado e sexuado, onde o agente de reprodução é denominado de esporo (ALEXOPOULOS et al., 1996). O desenvolvimento deste órgão é um processo de diferenciação das células
realizada, permitindo uma identificação segura do material examinado. Por exemplo, fungos do gênero Penicillium (Figura 2.9-3) são identificados através da observação microscópica de conidióforos com fiálides e de cadeias de conídios. Este gênero não apresenta vesículas como ocorre com Aspergillus (Figura 2.9-1). Para fungos do gênero Fusarium os aspectos macroscópicos de suas colônias podem variar de branco a cor púrpura e microscopicamente podem ser observados desde microconídios ovóides a elipsóides e macroconídios fusiformes septados, formados em conidióforos com fiálides. Como mostra a Figura 2.9-2, o fungo Fusarium moniliforme foi identificado em nível de gênero com base nos seus macroconídios fusiformes multiseptados e em nível de espécie através da análise em conjunto dos aspectos macro e microscópicos com o auxílio das chaves taxonômicas.
Baseado nos nossos resultados, a micota de M. azedarach, como também de C. fissilis parece ser altamente variada com predominância de dois gêneros: Aspergillus e Penicillium. Estudos realizados com outras plantas da família Meliaceae levaram ao isolamento de nichos bastante diferentes, entre eles espécies de Colletotrichum, Nodulisporium, Pestalotiopsis e Phomopsis (POLISHOOK et al., 1996; GAMBOA e BAYMAN, 2001; CANNON e SIMMONS, 2002). Algumas espécies de Aspergillus, Penicillium e Fusarium foram encontradas nas folhas de Guarea guidonea coletada em Porto Rico. A comparação dos fungos isolados de M. azedarach com os fitopatogênicos descritos na literatura (Tabela 2.1) sugeriu que esses microrganismos isolados como endofíticos pertencem a comunidades diferentes.
A identificação das espécies é de grande importância para os estudos de biodiversidade e relação com os hospedeiros. Como é conhecida, toda a forma de vida requer certas exigências nutritivas, em termos de substâncias químicas indispensáveis ao seu crescimento e ao seu funcionamento normal. Alguns fungos embora cresçam bem no ágar, outros o fazem pobremente ou simplesmente não se desenvolvem, exigindo nutrientes específicos como vitaminas e outras substâncias estimulantes (PELCZAR et al., 1996). O uso de diferentes meios, portanto, pode expandir a variedade e o número de espécies distintas dos isolados. Além disso, fatores como a temperatura de isolamento pode influenciar na biodiversidade dos microrganismos isolados, pois existem fungos que crescem exageradamente na temperatura ótima,
(antagonismo competitivo). Além disso, os métodos de isolamento da diversidade fúngica tem algumas limitações sérias em que muitos fungos não esporulam e uma vez estabelecida a cultura, a identificação dos mesmos foi feita baseada nos métodos de estruturas que esporularam e como conseqüência, não foi possível caracterizar todas as espécies.
As associações entre plantas e endofíticos podem fornecer excelentes modelos de sistemas para o estudo da evolução da simbiose microbiana. Se os endofíticos podem ser evoluídos de patógenos, as toxinas ativas contra os animais são provavelmente originárias de toxinas contra as plantas (CARROLL, 1988). Um estudo minucioso dos produtos secundários nos patógenos de plantas e endófitos poderia fornecer uma história fascinante da evolução bioquímica como, por exemplo, as toxinas alteradas das plantas para os animais. Isto significaria que a infecção microbiana dos hospedeiros indesejáveis pode proteger contra, no mínimo, alguns patógenos virulentos, os quais podem “imunizar” plantas hospedeiras contra patógenos fúngicos (CARROL, 1988). Pestalotiopsis 2% Trichoderma 5% Dematiáceo 9% Basidiomycetes 2% Não identificados 19% Nigrospora 5% Balansia 2% Gilmaniella 5% Penicillium 25% Aspergillus 21% Fusarium 5%
TABELA 2.2 – Ocorrência das espécies fúngicas em cada tecido sadio de Melia azedarach.
Grupo Fúngico Tecidos N. Total de
Isolados CR* XR CC L F Ascomycetes 01 Balansia sp - - 01 - - Coelomycetes 01 Pestalotiopsis versicolor - - 01 - - Basidiomycetes 01 No identification - - - - 01 Hyphomycetes 40 A. aculeatus Lizuka - - - 02 - A. carbonarius Bain - - - 01 - A. flavus Link - - - 01 - A. japonicus Saito - - - 01 01
A. niger van Tiejhem - - - 01 -
A. pulvurulentus Mc Alpine 01 - - - - Aspergillus sp - - - 03 01 F. nivale (Fr.) Ces 02 - - - - Fusarium moniliforme Sheldon 01 - - - - Gilmaniella sp. Barron - - 01 - 02 Nigrospora sp. Zimm - - - 03 - Penicillium citrinum - - 01 01 -
P. herquei Bainier and Sartory - - - - 01 P. janthinellum - - - - 01 P. rubrum Stoll - - - 02 01 P. rugulosum Thom. - 01 - - - P. simplicissimum - - 01 - - P. implicatum Biorgue - - - - 01 Penicillium sp. 02 - - 03 - Trichoderma koningii Ouderm 01 - - - - T. nivale 02 - - - - Trichoderma sp. Pers. 01 - - - - Outros 16 Dematiaceae - - 02 01 02 No identification 01 - 03 05 02 N. Total de Isolados em cada
Tecido
1 2
3 4
FIGURA 2.9 – Algumas espécies fúngicas isoladas dos tecidos sadios de Melia azedarach. 1) Aspergillus aculeatus Lizuka; 2) Fusarium moniliforme Sheldom; 3) Penicillium sp; 4) Trichoderma nivale. Aumento 400x.
5. CONCLUSÕES
Baseado em nossos resultados, a micota de M. azedarach parece ser altamente variada e extensiva com predominância dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Utilizando mais amostragens e introduzindo variações complementares (temperatura, meios cultura, entre outros) poderia esperar um número maior dessa diversidade nos tecidos de M. azedarach.
As coleções de culturas têm por objetivo a prestação de serviços para a comunidade científica, fornecendo culturas autênticas e informações sobre o modo de cultivo e preservação para propósitos científicos e industriais. Paralelamente, a preservação dos microrganismos isolados torna-se indispensável principalmente para aqueles organismos isolados de amostras ambientes que nem sempre podem ser encontrados novamente, e até mesmo, a tentativa de re-isolamento uma vez que podem faltar as propriedades desejadas exibidas pelas linhagens anteriores para o seu crescimento no interior de suas hospedeiras.