Em animais, os anticorpos são sintetizados primariamente por células plasmáticas, um tipo de linfócitos B diferenciados. Como as células plasmáticas não podem crescer em meio de cultura celular, elas não podem ser usadas como uma fonte de anticorpos in vitro.
Em 1975, KOHLER & MILSTEIN descreveram um método para imortalizar individualmente células secretoras de anticorpos a partir de um animal imunizado, permitindo a seleção de anticorpos monoclonais de especificidade definida, ou seja, de anticorpos homogêneos.
A técnica para produzir quantidades virtualmente ilimitadas de anticorpos com uma única especificidade para um determinante antigênico em particular revolucionou a imunologia. Em outras palavras, cada tumor monoclonal derivado de um único linfócito B, chamado mieloma, produz apenas anticorpos idênticos entre si. Esses tumores ocorrem espontaneamente no homem e podem ser induzidos experimentalmente por vários tratamentos em camundongos (KOHLER, 1986). A maioria dos mileomas secreta anticorpos com especificidades antigênicas desconhecidas, porque o processo de transformação que dá origem a esses tumores afeta os linfócitos B aleatoriamente e não é possível prever a especificidade de qualquer clone transformado dos linfócitos B ao acaso. Uma vez que os linfócitos B normais não conseguem crescer indefinidamente, tentativas têm se focalizado na imortalização dos linfócitos B para que produzam um anticorpo específico. Descrita em 1975, a primeira técnica a ser usada é conhecida por imortalizar os linfócitos B (KOHLER & MILSTEIN, 1975).
Este método consiste na fusão celular ou hibridização de células somáticas entre um linfócito B normal produtor de anticorpo e uma linhagem de mieloma, seguindo-se subseqüentemente a seleção de células fusionadas que secretam anticorpo da especificidade desejada, derivada da célula B normal. Essas linhagens celulares imortalizadas derivadas de fusões são chamadas de hibridomas, e os anticorpos que elas produzem são anticorpos monoclonais.
As linhagens de hibridomas podem ser obtidas por diversas técnicas de seleção. Uma delas foi através do uso da oubaína, um inibidor da enzima ATPase, enzima esta que promove a entrada K+ e saída de Na+ da célula. Outra forma foi
compostos é mediada primariamente pela redução ou perda da enzima hipoxantina- guanina fosforribosiltransferase (HGPRT). Outra técnica utilizada, e que deu origem à linhagem de mieloma SP2O, foi uma alteração no cromossoma 8 que desencadeia uma deficiência na enzima adenina-guanina fosforribosiltransferase (AGPRT) (HARLOW & LANE, 1988).
Essas primeiras linhagens de células de mieloma foram obtidas a partir de um tumor induzido por injeção de óleo mineral via intraperitoneal em camundongos Balb/c, as quais foram chamadas de MOPC-1 (plasmocitomas induzidos por óleo mineral). Após serem adaptadas para sobreviver em meio de cultura e se dividirem intensamente receberam o nome de MOPC-21. Após fusão com linfócitos B, alguns desses clones eram secretores de imunoglobulina enquanto outros não, e estes últimos foram selecionados para produção de hibridomas.
Existem diversas linhagens células de mieloma (Figura 12), tais como P3K, P3-X63Ag8, X63-Ag8.653, SP2O/Ag-14, NSI/1-Ag4-1, FOX-NY, etc. Essas linhagens foram obtidas de tumor de camundongo, com algumas especificações particulares. A linhagem P3K, oriunda da linhagem MOPC-21, é secretora de imunoglobulina, resistente à azaguanina e HGPRT negativa (alteração no cromossoma X). Quando essa linhagem deficiente dessa enzima foi cultivada em meio seletivo contento azacerina, a síntese de purina ficou bloqueada pela via de novo. Essa linhagem ficou conhecida como FOX-NY (isoladas da linhagem NS1/1-Ag4-1) que são HPRT negativa e AGPRT negativa (alteração no cromossoma 8) e também sintetizam a imunoglobulina (HARLOW & LANE, 1988).
Figura 12. Árvore da família de mieloma obtida em camundongos Balb/c, a partir da
linhagem MOPC21 até a linhagem SP2O. (il. color. adaptada do livro Antibodies - A Laboratory Manual, HARLOW & LANE, 1988)
M OPC 21
P3K
NSI/ 1-Ag4.1 P3-X63Ag8
Através de análises mais detalhadas, as linhagens de mieloma deveriam crescer em meio de cultura normal, ou talvez, poderiam não crescer em um meio seletivo, porque lhes faltava um gene funcional necessário para a síntese de DNA neste meio. As linhagens celulares que podem ser usadas como parceiras de fusão são criadas induzindo-se defeitos nas vias de síntese dos nucleotídeos (Figura 13). Na fusão de células normais com células de mieloma defeituosas o gene necessário para a sobrevida em meio seletivo é fornecido pelas células normais, de modo que somente os híbridos das células somáticas poderiam continuar a crescer nesse meio. Além disso, os genes das células de mieloma tornam esses híbridos imortais.
As células de mieloma utilizadas na fusão provêm de uma correção gênica para fazer com que essas células possam se dividir continuamente em meio de cultura in vitro, enquanto que as células secretoras de anticorpos provêm de genes funcionais de imunoglobulinas.
Células normais de animais sintetizam de novo nucleotídeos de purina e timidina, respectivamente, a partir do fosforribosil pirofosfato e do uridilato, em várias etapas, umas das quais consiste na transferência de um grupo metila ou formila do tetraiodofolato ativado. Drogas antifolínicas, como a aminopterina bloqueiam a reativação do tetraiodofolato, assim inibindo a síntese da purina e do timidilato. Como estas são componentes necessários ao DNA, a aminopterina bloqueia a síntese do DNA pela via de novo. As células tratadas pela aminopterina podem usar uma via de salvamento, na qual a purina é sintetizada a partir da hipoxantina fornecida exogenamente pelo uso da enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT), e o timidilato é sintetizado a partir da timidina pelo uso da enzima timidinocinase (TK). Por isso, se o meio de cultura for também suplementado com hipoxantina e timidina, as células crescem normalmente na presença da aminopterina (meio HAT). Entretanto as linhagens celulares (por exemplo, SP2O) poderão se tornar carentes em HGPRT se for mutagenizadas e selecionadas em guanina ou azaguanina, que são análogas de metabólitos normais do HGPRT, mas dão origem a purinas não funcionais.
Figura 13. Esquema da síntese de nucleotídeos. (il. color. adaptada do livro Imunologia Celular & Molecular. ABBAS, 2000)
Por outro lado, as células podem se tornar carentes em TK por mutagênese. Essas células negativas em HGPRT ou em TK não podem usar a via de salvamento e, portanto, poderão morrer no meio HAT. Quando células normais são fusionadas com células HGPRT-negativas ou TK-negativas, as células normais proporcionam as enzimas necessárias de modo que os híbridos sintetizem o DNA e cresçam no meio HAT.
Este princípio foi aplicado à geração de hibridomas produtores de anticorpo pelo desenvolvimento de linhagens de mieloma HGPRT-negativas ou TK-negativas. As linhagens de mieloma são as melhores células para se fundir aos linfócitos B, uma vez que dão origem a híbridos estáveis mais eficientemente que outras células (ABBAS, 2000).
Na época do desenvolvimento e estudo das primeiras fusões realizadas, os pesquisadores tiveram que buscar soluções para alguns interferentes que impossibilitavam a formação de hibridomas secretores de anticorpos, tais como (i) encontrar um “parceiro” ideal para fusão, (ii) definir condições ideais para que ocorra fusão célula-célula e (iii) escolher um sistema apropriado para selecionar células híbridas contra um background de células não fundidas (HARLOW & LANE, 1988).
Via de NOVO Via de SALVAMENTO
FOSFORRIBOSIL PIROFOSFATO + URIDILATO Aminopterina NUCLEOTÍDEOS TIMIDINA HIPOXANTINA Timidinaquinase (TK) Hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT) Enzimas ausentes em linhagens mutantes de mieloma usadas para
fusões
Via de NOVO Via de SALVAMENTO
FOSFORRIBOSIL PIROFOSFATO + URIDILATO Aminopterina NUCLEOTÍDEOS TIMIDINA HIPOXANTINA Timidinaquinase (TK) Hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT) Enzimas ausentes em linhagens mutantes de mieloma usadas para
Neste trabalho de pesquisa foi fusionada uma linhagem de mieloma de camundongos (SP2O) com linfócitos presente no baço e nos linfonodos de camundongo previamente imunizado com microcistina-LR conjugada ao mcKLH. Foram selecionados os híbridos para crescimento em meio HAT. Nestas condições, as células de mieloma não fundidas morrem, porque não podem usar a via de
salvamento, e as células B não podem viver mais do que uma a duas semanas,
porque não são imortalizadas, de modo que só os híbridos poderão crescer. Dentre as características mais importantes da linhagem de célula de mieloma estão a capacidade deste tipo de célula não ser secretora de imunoglobulina e o uso do polietilenoglicol como agente de fusão, por sua maior facilidade técnica. As células fusionadas são então cultivadas, duplicadas e o sobrenadante de cada poço no qual as células estão crescendo é analisado por ELISA para avaliar seu comportamento frente ao antígeno solúvel no qual o camundongo foi imunizado. Uma vez identificados os poços positivos, isto é, os que contêm hibridomas produzindo o anticorpo desejado, as células são clonadas por diluição limitante no mínimo duas vezes, para garantir que em cada poço de cultura contenha somente uma única célula de hibridoma. Os clones que estão produzindo anticorpos monoclonais de especificidade única são então isolados. A fim de serem produzidas grandes quantidades de anticorpos monoclonais, os hibridomas podem crescer em grandes volumes em cultura ou como tumores ascíticos em camundongos singênicos.