Edirne Saray Bahçeler

Para a análise da expressão gênica diferencial, foram utilizados quatro protocolos. Estes protocolos diferem na metodologia estatística aplicada para encontrar genes diferencialmente expressos.

Os genes diferencialmente expressos (DE) com função descrita, encontrados por meio das análises dos programas Cuffdiff2, DESeq e edgeR (protocolos 1 e 2) podem ser visualizados na Tabela 3, de acordo com 4 protocolos.

Tabela 3: Genes diferencialmente expressos encontrados nas amostras

divergentes para índice de marmorização da carne.

Cuffdiff2

Ensemble Gene ID Gene (Fold Change*) Log2 p valor q valor ENSBTAT00000010554 OXT 130,871 5,00e-05 0,025 ENSBTAT00000015750 PCBD1 360,537 5,00e-05 0,025 ENSBTAT00000026100 BOLA-DQB -142,885 5,00e-05 0,025 ENSBTAT00000045694 HBB -31,094 1,00e-04 0,042 ENSBTAT00000057500 HSPA6 145,827 5,00e-05 0,025

DESeq

Ensemble Gene (Fold Change*) Log2 p valor q valor ENSBTAG00000011985 FLVCR2 -693,044 4,55e-08 0,057

edgeR Protocolo 1

Ensemble Gene (Fold Change*) Log2 p valor q valor ENSBTAG00000039688 FAM101A -159,506 7,89e-08 0,028 ENSBTAG00000012710 GHRH -769,440 5,55e-07 0,023 ENSBTAG00000046133 MIR2887-2 -828,872 1,44e-08 0,007 ENSBTAG00000011866 PCBD1 392,283 2,71e-07 0,002

edgeR Protocolo2

Ensemble Gene (Fold Change*) Log2 p valor q valor ENSBTAT00000057500 HSPA6 263,487 4,05e-07 0,011 *As estimativas de fold change (expressão relativa) são referentes ao grupo de alto índice de marmoreio na carne. Em negrito estão os genes que apresentaram expressão diferencial significativa em mais de um protocolo.

A análise realizada por meio do programa Cuffdiff2 revelou cinco genes DE anotados, sendo três induzidos e dois reprimidos com relação ao grupo de carne com alto índice de marmoreio. Os programas DESeq e edgeR protocolo 2 apresentaram apenas um gene DE cada, sendo um reprimido e um induzido, respectivamente, em relação ao grupo de alto marmoreio. O edgeR protocolo1, revelou quatro genes DE, três reprimidos e um induzido, também em relação ao grupo de alto marmoreio.

Os transcritos PCBD1 e HSPA6 foram diferencialmente expressos (significativos) em análises distintas (Cuffdiff2 e edgeR protocolo1; Cuffdiff2 e edgeR protocolo2, respectivamente).

O transcrito referente ao gene PCBD1 (pterin-4alpha-carbinolamine dehydratase), foi mais expresso no grupo de alto marmoreio. Li et al., (2012), em estudo de associação genômica ampla (GWAS) com bovinos cruzados Angus x Charolês, relataram associação entre este gene e a espessura de gordura subcutânea.

O transcrito HSPA6 (proteínas de choque térmico família de A (Hsp70) membro 6) codifica uma proteína denominada chaperona que está diretamente envolvida na proteção das proteínas contra estresses ambientais e genéticos, auxiliando-as na formação correta de suas estruturas tridimensionais (MAYER e BUKAU, 2005). Em estudo de expressão gênica com células sanguíneas de humanos obesos e com peso considerado normal, este gene foi mais expresso em pessoas obesas (MINCHENKO, 2015) e no presente estudo, foi mais expresso em animais com alto índice de marmoreio.

O transcrito OXT (ocitocina neurofisina pré-propeptideo), que codifica a ocitocita, foi mais expresso nas amostras de alto marmoreio. A ocitocina é sintetizada no hipotálamo e armazenada na hipófise posterior, é hidrossolúvel e por isso pode ser transportada livremente pela corrente sanguínea. Sua mais importante e conhecida função, está relacionada ao processo de lactogênese (COLLIER et al. 1984). A ocitocina também está envolvida no processo biológico conhecido como “resposta aos lipídios” (Figura 5). Segundo CARBON et al. (2009), este processo biológico está relacionado a mecanismos como secreção, produção de enzima e expressão gênica, que resultem em uma

mudança de estado ou atividade de uma célula em resposta a um estímulo lipídico. Além disto, a ocitocina atua no sistema de armazenamento e gasto energético de lipídios e atua em processos como a lipólise, atividade secretora e plasticidade (FONSECA – ALANIZ, et al., 2010). De Jager et al. (2011), em estudo com bovinos Brahman, relataram a expressão desse gene em músculo Longissimus dorsi, quantificada pelas técnicas de microarranjo e qRT-PCR.

Figura 5: Análise de enriquecimento do gene OXT realizada por meio do aplicativo ClueGO.

Neste trabalho, os transcritos que são codificados pelos genes HBB (hemoglobina beta) e FLVCR2 (feline leukemia virus subgroup C cellular receptor family member 2), relacionados ao metabolismo das heme, principal componente da hemoglobina, (OTTERBEIN, et al.,2003 e DUFFY et al., 2010), foram mais expressos em animais com baixo índice de marmoreio, indicando que as taxas de hemoglobinas podem estar relacionadas à quantidade de

gordura no organismo. Essa associação foi observada anteriormente em humanos. Pessoas com peso considerado adequado apresentam maior quantidade de hemoglobinas enquanto que aquelas com sobrepeso apresentam baixos níveis desta molécula no sangue (BAGNI et al.,2013). Estes genes estão inter-relacionados por meio dos processos biológicos “transporte” e “single-organism transport” (Figura 6) e as proteínas codificadas por eles atuam movimentando de forma dirigida substâncias como íons e oxigênio inter ou intra-celulas (OTTERBEIN, et al.,2003; CARBON et al., 2009).

Figura 6: Análise de enriquecimento dos genes HBB e FLVCR2 realizada por

meio do aplicativo ClueGO. Os círculos em amarelo destacam os processos biológicos nos quais os dois genes estão envolvidos. Os círculos verdes e azuis referem-se aos genes FLVCR2 e HBB respectivamente.

O transcrito FAM101A (Filamin-Interacting Protein 101A) foi mais expresso em animais de baixo índice de marmoreio. Em ratos, a proteína codificada pelo FAM101A se interage com as filaminas A e B ao longo da

estrututa da actina nas células ATDC5, que fazem parte do tecido cartilaginoso (MIZUHASHI et al., 2014). Estudos de GWAS em humanos têm relatado que este gene está relacionado à regulação da adiponectina (hormônio que regula a glicemia e o catabolismo de ácidos graxos) e ao colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade) (WILLER et al., 2013 e WU et al., 2014).

O gene Bola-DQB (antígeno leucocitário bovino), mais expresso no grupo de baixo marmoreio, foi associado a características de crescimento em Bos taurus (BATRA et al. 1989 e STEAR et al. 1989). A marmorização é um processo que ocorre no animal adulto (após o período de crescimento), sendo que os tecidos gordurosos se depositam primeiro nas regiões abdominal, intermuscular e subcutâneo, respectivamente, e por último na região intramuscular (LUCCHIARI FILHO, 2000). Assim, esse gene pode estar relacionado à deposição de gordura de forma tardia nos animais.

O transcrito que codifica o hormônio GHRH (hormônio liberador de hormônio do crescimento), foi mais expresso em animais com baixo índice de marmoreio. O GHRH estimula a liberação de GH (hormônio do crescimento), que é fundamental para a regulação do metabolismo de lipídios, pois o aumento de GH estimula a síntese proteica, enquanto a sua inibição, estimula a síntese de lipídios (MCMAHON et al., 2001). Assim a indução do GHRH em animais de baixo marmoreio, pode estar relacionado ao aumento da síntese proteica e, consequentemente, diminuição do metabolismo lipídico.

O transcrito referente ao microRNA MIR2887-2 foi mais expresso no grupo com baixo índice de marmorização da carne. Segundo Wang et al. (2013), em bovinos, o MIR2887-2 foi mais expresso em amostras de gordura de marmoreio quando comparada à sua expressão em gordura subcutânea, o

que indica que este microRNA pode ser importante no processo de deposição de gordura intramuscular.

Trabalhos de GWAS com animais Bos taurus puros e cruzados não encontraram genes em comum com este trabalho (BARENDSE et al., 2011; RAMAYO-CALDAS et al., 2014). César et al. (2014 e 2015), em estudo de GWAS e expressão gênica em tecido muscular de bovinos Nelore castrados também encontraram genes diferentes dos que foram aqui descritos. Como sugerido por Magalhães (2015), divergências na expressão de genes observados em estudos distintos podem ocorrer devido a diferenças genéticas entre rebanhos.

5. Conclusão

O estudo do transcriptoma de animais divergentes para marmoreio da carne revelou genes envolvidos no metabolismo de lipídios, obesidade e transporte de moléculas pelo sistema circulatório. Também foram encontrados genes relacionados ao sistema de contração do músculo e ao crescimento. Esses dados retratam a complexidade dos mecanismos moleculares relacionados à deposição da gordura intramuscular no músculo Longissimus dorsi. A investigação dos genes revelados neste estudo podem auxiliar no desenvolvimento de estratégias para a seleção de animais com maior marmorização da carne.

6. Referências

ANDERS, S.; HUBER, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biology, v.11, R106, 2009.

ANDERS, S.; MCCARTHY, D.J.; CHEN, Y.; OKONIEWSKI, M.; SMYTH, G. K.; HUBER W.; ROBINSON, M. D. Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and Bioconductor. Nature Protocols, v. 8, p. 1765–1786, 2013.

ANDERS, A. PYL P. T.; HUBER, W. HTSeq — A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics, v.31, n.2, p.166-169, 2014.

BAGNI, U. V.; LUIZ, R.R.; VEIGA, G.L. Overweight is associated with low hemoglobin levels in adolescent girls. Obesity Research Clinical, v. 7, n. 3, p.218–229, 2013.

BARENDSE, W. Haplotype Analysis Improved Evidence for Candidate Genes for Intramuscular Fat Percentage from a Genome Wide Association Study of Cattle. Plos One, v. 6. 2011.

BATRA, T.R.; LEE, A.J.; GAVORA, J.S.; STEAR, M.J. CLASS I alleles of the bovine major histocompatibility system and their association with economic traits. Journal Dairy Science, v. 72, p. 2115–2124, 1989.

BINDEA G, MLECNIK B, HACKL H, CHAROENTONG P, TOSOLINI M. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. v. 25, n. 8, p. 1091-1093, 2009.

BO, L.; COLIN N. D. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome, BioMed Central, v.12, n.323, 2011. BOLGER, A. M.; LOHSE, M.; USADEL, B. TRIMMOMATIC: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics, btu170, 2014.

CARBON, S.; IRELAND, A.; MUNGALL, C.J.; SHU, S.; MARSHALL, B.; LEWIS, S. AmiGO: online access to ontology and annotation data.

Bioinformatics, v.25, n.2, p.288–289, 2009.

CARVALHO, M.C.C.G; SILVA, D. C.G. Sequenciamento de DNA de nova geração e suas aplicações na genômica de plantas. Ciência Rural, v.40, n.3, 2010.

CESAR, A. S.M; REGITANO, L. C. A; MOURÃO, G. B; TULLIO, R. R; LANNA, D. P.D; NASSU, RENATA T; MUDADO, M. A; OLIVEIRA, P. S.N; NASCIMENTO, M. L; CHAVES, A. S; ALENCAR, M. M; SONSTEGARD, T. S; GARRICK, D. J; REECY, J. M. COUTINHO, L. L. Genome-wide association study for intramuscular fat deposition and composition in Nellore cattle. BMC

Genetics, p. 15:39, 2014.

CESAR A. S. M.; REGITANO, L.C.A; KOLTES, J. E.; FRITZ-WATERS, E.R.; LANNA, D. P.D.; GASPARIN, G.; MOURÃO, G. B.; OLIVEIRA, P. S.N.; REECY. J. M.; COUTINHO, L.L. Putative Regulatory Factors Associated with Intramuscular Fat Content. Plos One, v. 10, n .6, 2015.

CHAPPLE, R.H.; TIZIOTO, P.C.; WELLS, K.D. Characterization of the rat developmental liver transcriptome. Physiological Genomics, v.45, n.8, p.301- 311, 2013.

CHEN, D.; LI, W.; DU, M.; WU, M.; CAO, B. Sequencing and Characterization of Divergent Marbling Levels in the Beef Cattle (Longissimus dorsi Muscle) Transcriptome. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, v. 28, n. 2, p. 158-165, 2015.

COLLIER, D.; MCNAMARA, J.P.; WALLACE. C. R.; DEHOFF, M. H. A review of endocrine regulation of metabolism during lactation. Journal of Animal

Science, v.59, p.498 -510, 1984.

CUNDIFF, L.V. Breeds and Genedintics. In: POND, W.G.; BELL, A.W. (Ed.) Encyclopedia of Animal Science. Ithaca: Cornell, 2004. 800 p.

DE JAGER, N.; HUDSON, N. J.; REVERTER, A.; WANG,H.; NAGARAJ, S. H.; CAFE, L.M.; GREENWOOD,P. L.; BARNARD, R.T.; KONGSUWAN, K. P.; DALRYMPLE, B.P. Chronic exposure to anabolic steroids induces the muscle expression of oxytocin and a more than fiftyfold increase in circulating oxytocin in cattle. Physiological Genomics, v. 43, n. 9, p.467-478, 2011.

DUFFY, S. P.; SHING, J.; SARAON, P.; BERGER, L. C.; EIDEN, M. V.; WILDE, A.; TAILOR, C. S. The Fowler syndrome-associated protein FLVCR2 is an importer of heme. Molecular and Cellular Biology, v. 30, p. 5318-5324, 2010.

FONSECA-ALANIS, M.H.; TAKADA, J.; ALONSO-VALE, M.I.C. The adipose tissue as a regulatory center of the metabolismo. Arquivo Brasileiro de

endocrinologia e metabolismo, v. 50, p. 216-219, 2006.

GOFF, S. A.; VAUGHN, M.; McKAY, S. et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science, v. 2, n. 34, 2011.

HUANG, W.; SHERMAN, B. T.; LEMPICK, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature

LANGMEAD, B.; TRAPNELL, C.; POP, M.; SALZBERG, S.L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.

Genome Biology, v.10, R25, 2009.

Lee, H. J.; Park, H. S.; Kim,Yoon, K.D.; Seo, S. Comparison of Metabolic Network between Muscle and Intramuscular Adipose Tissues in Hanwoo Beef Cattle Using a Systems Biology Approach. International Journal of

Genomics, v. 2014, 2014.

LI, H. Genomic Variation and Whole Genome Association Studies of Economically Important Traits. Thesis submitted to the Faculty of Graduate Studies, Edmonton, Alberta, 2012.

LUCHIARI FILHO, A. Pecuária da carne bovina. São Paulo: LinBife, 2000. 134p.

MAGALHÃES, A. F. B. Utilização de informações genômicas para o melhoramento genético de características da carne em bovinos da raça Nelore. Tese, FCAV, UNESP, 60p, 2015.

MALONE, J. H.; OLIVER, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology, v.9, n. 34, 2011.

MAYER, M.P.; BUKAU, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences, v.62, n. 6, p.670-84, 2005. MCMAHON, C.D.; RADCLIFF, R.P.; LOOKINGLAND, K.J. Neuroregulation of growth hormone secretion in domestic animals. Domestic Animal

Endocrinology, v. 20, p. 65 – 87, 2001.

MICHAL, J.J.; ZHANG, Z.W.; GASKINS, C.T.; JIANG, Z. The bovine fatty acid binding protein 4 gene is significantly associated with marbling and

subcutaneous fat depth in Wagyu x Limousin F2 crosses. Animal Genetics, v. 37, p. 400–402, 2006.

MINCHENKO, D. O. Expression of Endoplasmic Reticulum Stress Related Genes in Blood Cells of Obese Boys with and without Insulin Resistance.

International Journal of BioMedicine, v. 5, n.1, p. 24-29, 2015.

MIZUHASHI, K.; KANAMOTO, T.; MORIISHI, T.; MURANISHI, Y.; MIYAZAKI, T.; TERADA, K.; OMORI, Y.; ITO, M.; KOMORI, T.; FURUKAWA, T. Filamin- interacting proteins, Cfm1 and Cfm2, are essential for the formation of cartilaginous skeletal elements. Human Molecular Genetics, v. 23, n.11, p. 2953-2967, 2014.

OTTERBEIN, L.E.; SOARES, M.P.; YAMASHITA, K.; BACH, F.H. Heme oxygenase-1: unleashing the protective properties of heme. Trends in

Immunology, v. 24, p.449–455, 2003.

RAMAYO-CALDAS, Y.; FORTES, M.R.; HUDSON, N.J.; PORTO-NETO, L.R.; BOLORMAA, S. BARENDSE, W. A marker-derived gene network reveals the regulatory role of PPARGC1A, HNF4G, and FOXP3 in intramuscular fat deposition of beef cattle. Journal of Animal Science, v.92, p. 2832–2845, 2014.

RAMAYO-CALDAS, Y.; MACH, N.; ESTEVE-CODINA, A.; COROMINAS, J.; CASTELLO, A.; BALLESTER, M. Liver transcriptome profile in pigs with extreme phenotypes of intramuscular fatty acid composition. BMC Genomics, v.13, n. 547, 2012.

RAMOS, E.M.; GOMIDE, L.A.M. Avaliação da qualidade de carnes: fundamentos e metodologias. Viçosa, MG: Editora UFV, 2007. 599p.

RAPAPORT, F; KHANIN, R.; LIANG, Y.; KREK, A.; ZUMBO. P.; MASON, C.E.; SOCCI, N. D.; BETEL, D. Comprehensive evaluation of differential gene expression analysis methods for Rna-seq data. Genome Biology, v. 14, R95, 2013.

RINGNÉR, M. What is principal component analysis? Nature Biotechnology, v. 26, n. 3, p. 303–4, 2008.

ROBINSON, M.D.; MCCARTHY, D.J.; SMYTH, G.K. “edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.”

Bioinformatics, v.26, n.1, p. 139–140, 2010.

ROBINSON, M.D.; OSHLACK, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology, v.11, R25, 2010. STEAR, M.J.; POKORNY, T.S.; MUGGLI, N.E.; STONE, R.T. The relationships of birth weight, preweaning gain and postweaning gain with the bovine major histocompatibility system. Journal Animimal Science, v. 67, p. 641–649, 1989. TIZIOTO, P.C.; COUTINHO, L.L.; DECKER, J. E.; SCHNABEL, R. D.; ROSA, K.O.; OLIVEIRA, P.S.N.; SOUZA, M.M.; MOURÃO, G.B.; TULLIO, R.R.; CHAVES, A.S.; LANNAD.P.D.; ZERLOTINI-NETO, A.; MUDADU, M.A.; TAYLOR, J.F.; REGITANO, L.C.A. Global liver gene expression differences in Nelore steers with divergent residual feed intake phenotypes. BMC Genomics, v.16, p. 216, 2015.

TRAPNELL C, HENDRICKSON DG, SAUVAGEAU M, GOFF L, RINN JL, PACTHER L. Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq. Nature Biotechnology. v.31, p.:46–53, 2013.

TRAPNELL C, PACHTER L, SALZBERG SL. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics.v.25, n.9, p.1105–1111, 2009.

TRAPNELL C, ROBERTS A, GOFF L, PERTEA G, KIM D, KELLEY DR.Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature Protocols, v.7, n.3, p.562–78, 2012.

USDA - UNITED STATES DEPARTAMENT OF AGRICULTURE. U.S. Standards for Grades of Feeder Cattle. Washington: USDA, 2000. 4p.

WANG, Z.; GERSTEIN, M.; SNYDER, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. Advance Online Plublication, 2008. WANG, H.; ZHENG, Y.; WANG, J.; LI, H. Identification of microRNA and bioinformatics target gene analysis in beef cattle intramuscular fat and subcutaneous fat. Molecular BioSystems, v. 9, n. 2154, 2013.

WILLER, C.J.; SCHMIDT, E.M.; SENGUPTA, S.; PELOSO, G.M.; GUSTAFSSON, S.; KANONI, S.; GANNA, A.; CHEN, J.; BUCHKOVICH, M.L.; MORA, S. Discovery and refinement of loci associated with lipid levels. Nature

Genetics, v.45, n.11, p.1274-1283, 2014.

WU, Y.; GAO, H.; LI, H.; TABARA, Y.; NAKATOCHI, M.; CHIU, Y.F.; PARK, E.J.; WEN, W.; ADAI,R L.S.; BORJA, J.B.; CAI, Q.; CHANG, Y.C.; CHEN, P.; CROTEAU-CHONKA, D.C.; FOGARTY, M.P.; GAN, W. A meta-analysis of genome-wide association studies for adiponectin levels in East Asians identifies a novel locus near WDR11-FGFR2. Human Molecular Genetics, v.23, n.4, p.1108-1119, 2014.