Molecular Level
ÖZET
Isı şok protein 90 (Hsp90) hücre içerisinde en yaygın olarak bulunan bir şaperon proteindir ve onkogenik proteinlerin (transkripsiyonel faktörler, tirozin kinazlar, steroid reseptörleri, hücre döngüsü regülatörleri) doğru katlanmasında, düzenlenmesinde ve stabilizasyonunda hayati roller oynamaktadır. Kanser hücrelerinde Hsp90 apoptotik yolakları baskılar ve kanserli hücrelerin proliferasyonunu ve metastaz, anjiyogenez, invazyon ve ilaç direnci sinyal yolaklarının aktivasyonunu tetikler. Bundan dolayı kanserli hücrelerin devamlılığı için Hsp90 olmazsa olmaz bir şaperon proteindir. Hsp90 N-terminal domaininde (NTD) yüksek derecede korunmuş ATP bağlanma bölgesine sahiptir. Hsp90 şaperon görevini yerine getirmek için ATP'nin hidroliz enerjine ihtiyaç duymaktadır. Bundan dolayı, Hsp90'nın ATPaz aktivitesinin inhibisyonu hedefe spesifik kanser tedavisi için önemli stratejidir. Bugüne kadar sayısız bileşik Hsp90 inhibitörü olarak değerlendirilmiştir fakat klinik öncesi ve klinik çalışmalarda bileşiklerin yan etkileri, çözünürlük problemleri ve düşük tedavi etkinlikleri önemli limitasyonlar ortaya çıkartmıştır. Bundan dolayı şu anda kanser ilacı olarak FDA onaylı hiçbir Hsp90 inhibitörü yoktur. Bu çalışmada, AY0685 bileşiği Hsp90 inhibitörü olarak dizayn edildi ve sentezi gerçekleştirildi. AY0685 inhibitörünün antikanser aktivitesi insan meme, kemik, karaciğer, kolon, endotel ve lösemi kanser hücrelerinde in-vitro deneyler ile değerlendirildi. Hsp90 ve AY0685 inhibitörü arasındaki bağlanma ve etkileşim parametreleri moleküler docking ve biyokimyasal deneyler ile belirlendi. AY0685 inhibitörü ile insan meme kanserindeki gen ekspresyonların değişimi mikroarray ve PCR array deneyleri belirlendi. Tüm bu sonuçlara göre, AY0685 hedefe spesifik kanser tedavisinde umut veren aday Hsp90 inhibitörüdür.
ABSTRACT
Heat shock protein 90 (Hsp90) is an abundant and ubiquitous chaperone protein which plays vital roles in proper folding, regulation and stabilization of oncogenic client proteins (transcriptional factors, tyrosine kinases, steroid receptors, cell cycle regulators). In cancer cells, Hsp90 suppresses apoptotic pathways and stimulates cancer cell proliferation and activation of metastasis, angiogenesis, invasion, and drug resistance signaling pathways. Therefore, Hsp90 is an essential chaperone protein for cancer cell survival. Hsp90 has highly conserved ATP binding pocket in N-terminal domain (NTD). Hsp90 require ATP hydrolyses energy to perform these chaperone processes. Therefore, inhibition of Hsp90 ATPase activity has been important strategy for the target specific cancer treatment. To date, numerous compounds have been evaluated as Hsp90 inhibitors, however; their side effects, solubility problems and low therapeutic efficiency have revealed some important limitations in pre-clinical and clinical studies. Hence, there is no FDA approved Hsp90 inhibitors as a cancer chemotherapeutic. In this study, AY0685 compound was designed and synthesized as Hsp90 inhibitor. Anticancer activity of AY0685 inhibitor was evaluated on human breast, bone, liver, colon, endothelial and leukemia cancer cells with using in-vitro assays. Binding and interaction parameters between Hsp90 and AY0685 inhibitor were determined with molecular docking studies and biochemical experiments. Alteration of breast gene expression with AY0685 inhibitor was identified by microarray and PCR array experiments. All results indicated that, AY0685 are promising candidate as Hsp90 inhibitor in target specific cancer treatment.
Öğrenci Adı Soyadı Kübra AÇIKALIN COŞKUN
Danışmanı Prof. Dr. İsa GÖKÇE Prof. Dr. Yusuf TUTAR
Doktora Tez Başlığı Protein Katlanma Yolaklarının Engellenmesiyle Kanser
Mekanızmasının İnhibe Edilmesi için HSP70 Substrat Bağlanma Bölgesine Spesifik İnhibitör Dizaynı
Designing specific Hsp70 Substrat Binding Domain Inhibitor for Perturbing Proteı̇n Folding Pathways to Inhibit Cancer Mechanism
ÖZET
Hsp70 enfeksiyon, oksidatif stress, sıcaklık, yüksek ateş ve tümör oluşumu gibi çeşitli stres faktörlerinde bütün hücrelerde bu strese cevap olarak eksprese edilen moleküler bir şaperondur. Stres durumunda Hsp70 kendi protein substratına bağlanarak şartlar düzelene kadar agregasyon ve denaturasyona karşı onları stabilize eder. Hsp'ler onkogenezizde, tümör yayılımında ve kemotörapik ajanların direnç göstermesinde kat-kıda bulunur. Aşırı Hsp90 ve Hsp70 ekspresyonu birçok tümörün proliferasyonu ve sağ kalımıyla bağlantılıdır. Literatürde önemli bir yeri olan Hsp90 inhibisyonuna benzer bir yaklaşımla Hsp70'in ATP hidrolizi inhibisyon çalışmaları farklı araştırma grupları tara-fından çalışılmıştır ve Hsp70 inhibitörleri dizayn edilmiştir. Hsp70 ATP domaininin daha derin olması ve nükleotidin polar etkileşimlerle bağlanması nedeniyle dizayn edilen inhibitör ajanlarının ilaç gelişimi için klinik denemelere uygun olmadığı belirlenmiştir. Aynı zamanda bugüne kadar yapılan substrat bağlanma domaini (SBD) inhibitörleri kısa peptitlerden oluşmaktadır. Benzer şekilde bu yapılar da ilaç dizaynı için uygun değildir. Bu nedenle insan Hsp70 inhibitörleri geliştirmek ayrıca biyouyumlu ilaç benzeri madde kriterlerini sağlamak için, çalışmamız Hsp70'in SBD üzerine yoğunlaşmıştır. Çalışmamızda Hsp70 SBD inhibitörü olan PES'den yola çıkılarak bir inhibitör (KBR1307) tasarlandı ardından Hsp70 ve koşaperonlarla yapılan moleküler simülasyon çalışmalarıyla bağlanma enerjileri ve inhibisyon katsayıları belirlendi. In-vitrodeneylerlefarklı insan kanser hücre hatlarında anti kanser etkisi belirlendi. Saflaştı-rılan Hsp70 proteini ile dizayn edilen inhibitör varlığında ve yokluğunda biyokimyasal deneyler yapıldı. Tüm bu deneyler PES inhibitörü kontrol alınarak gerçekleştirildi. Bu-lunan sonuçlar KBR1307 inhibitörümüzün umut vaad eden bir inhibitör olduğunu ve PES'e göre çok daha etkin olduğunu gösterdi.
ABSTRACT
Hsp70 is a chaperone which is expressed in all cells as stress response such as infection, oxidative stress, temperature, high fever, and tumor formation. During stress, Hsp70 binds to its substrate protein to stabilize it against aggregation and denaturation till ambient conditions are established. Hsps involved in oncogenesis, tumor invasion, and resistance of chemotherapic agents. It is believed that cancer cells overexpress proteins due to their unnatural growth rate. Overexpression of Hsp90 and Hsp70 are correlated with several tumor proliferation and cell survival. Therefore, recently Hsps become important targets in cancer therapy. Hsp70's ATP hydrolysis inhibition were studied by different research groups in a similar fashion with that of Hsp90 and Hsp70 inhibitors were designed. Designed inhibitor agents were not find suitable for clinical trials since Hsp70 ATP domain is deeper and nucleotide binds to the cavity with polar interactions. Meanwhile, all designed inhibitors for substrate binding domain (SBD) were peptide based. By the same token, these molecules were not proper for drug design. For this reason to develop human Hsp70 inhibitor under bioavailable drug-like criteria, this work focused on Hsp70's SBD. The work designed an inhibitor (KBR1307) by using PES as template and then, binding constants and inhibition constants were determined for Hsp70 and its co- chaperonesin silico. In vitro experiments were performed at different cancer cell lines to determine the inhibitor anticancer effects. Biochemical experiments were performed with purified Hsp70 protein in the presence-absence of designed inhibitor. All these experiments performed with PES control. The results provide that KBR1307 is a promising inhibitor and has better activity compared to PES.