Yöntem ve değerlendirme: 20 ˚C’de saklanan materyaller çıkarılıp çözünmesi beklendikten sonra 5 kez steril PBS ile yıkandı Ardından kit üreticisinin öneriler

doğrultusunda DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Almanya) ile DNA izole edildi.

1. 25 μg doku ya da 200 μl kist sıvısı 1.5 ml’lik mikrosantifüj tüpüne aktarıldı. Üzerine 180 μl buffer ATL eklendi.

2. 20 μl proteinaz K eklendi ve 56˚C’de dokular eriyene kadar (2-12 saat) bekletildi. İnkübasyon sırasında ara ara örnekler vortekslendi.

3. İnkübasyon sonunda örnekler 15 sn vortekslenerek üzerlerine 200 μl buffer AL eklendi, vortekslendi. Daha sonra 200 μl saf etanol (Sigma-Aldrich, ABD) eklendi, tekrar vortekslendi.

4. Mikrosantifüj tüp içeriği toplama tüpü içindeki DNeasy Mini spin kolonuna aktarıldı. 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.

5. Toplama tüpü atıldı. DNeasy Mini spin kolonu yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. Üzerine 500 μl buffer AW1 eklendi ve 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.

6. Toplama tüpü atıldı. DNeasy Mini spin kolonu yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. Üzerine 500 μl buffer AW2 eklendi ve 14000 rpm’de 3 dakika santrifüj edildi.

7. Toplama tüpü atıldı. DNeasy Mini spin kolonu yeni bir mikrosantifüj tüpüne konuldu. Üzerine 100 μl buffer AE eklendi ve oda sıcaklığında 1 dakika beklendikten sonra 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.

8. 7. aşama tekrar edildi. mikrosantifüj tüpünde kalan materyal DNA eldesi olarak, kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklandı.

Elde edilen ürünlerde DNA varlığını araştırmak için 10 μl izolasyon ürünü ile 2 μl yükleme boyası karıştırılıp %1’lik agaroz jelde kuyulara yüklendi. Elektroforez tampon solüsyonu olarak 0.5x TBE kullanıldı ve elektroforez cihazında 90 voltta 1 saat süresince yürütüldü. UV ışığı altında net bir bant oluşturduğu görülen örnekler çalışmanın devamında kullanıldı. Elde edilen DNA miktarı spektrofotometrede ölçülerek belirlendi.

Ribozomal Deoksiribonükleik Asit ‘‘Internal Transcribed Spacer 1’’ Gen Bölgesi Kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Restriksiyon Fragman Uzunluğu Polimorfizmi Yönteminin Uygulanması

Echinococcus granulosus’un rDNA ITS1 gen bölgesi kullanılarak yapılan PCR-RFLP

uygulamasında; Bowles ve McManus’un (50) tanımladığı yöntem modifiye edilerek kullanıldı.

A. Kullanılan kimyasallar:

1. 25 mM MgCl2 solüsyonu: 25 μl 100 mM MgCl2 (Bioron, Almanya) solüsyonuna

75 μl distile su eklendi.

2. 2 mM deoksiribonükleozid trifosfat karışımı: Her bir deoksiribonükleozid trifosfat (dNTP, 100 mM; Bioron, Almanya)’tan 2 μl alınıp 92 μl distile su ile karıştırıldı.

3. 0.5x TBE tampon solüsyonu: 10x TRIS borate–EDTA buffer solüsyon (Sigma, ABD) distile su ile 1/20 oranında sulandırıldı.

4. Primerler: BD1 ve 4S (Bioron, Almanya) primerleri önce her biri için belirtilen nmol değerlerine göre 100 μM olacak şekilde distile su ile sulandırıldı. Ardından distile su ile 1/4 oranında sulandırılarak 25 μM’lık konsantrasyon elde edildi.

5. 10x PCR tamponu (Bioron, Almanya): KCl : 500 mM Tris HCl pH:8.8 : 100 mM Tween-20 : %0.1 MgCl2 : 15 mM

6. %1,5 agaroz jel: 0.75 g agaroz (Sigma, ABD) 0.5x TBE tampon solüsyonu ile 50 ml’ye tamamlandı. Karışım; mikrodalga fırında kaynatıldı, soğuması için bir süre bekletildi, sonra içine 2.5 µl etidyum bromid (10 mg/ml, Sigma, ABD) eklendi.

7. %3 agaroz jel: 1.5 g agaroz (Sigma, ABD) 0.5x TBE tampon solüsyonu ile 50 ml’ye tamamlandı. Karışım; mikrodalga fırında kaynatıldı, soğuması için bir süre bekletildi, sonra içine 2.5 µl etidyum bromid (10 mg/ml, Sigma, ABD) eklendi.

8. Taq DNA polimeraz, 5U/µl (Bioron, Almanya) 9. 6x yükleme boyası (Sigma, ABD)

10. AluI, 10 U/µl (Bioron, Almanya)

11. MspI (HpaII), 10 U/µl (Fermentas, Litvanya) 12. HhaI, 10 U/µl (Fermentas, Litvanya)

13. RsaI, 12 U/µl (Bioron, Almanya)

14. DNA boyut markırı (Q’RangeRuler 100 bp DNA Ladder; Fermentas, Litvanya) B. Yöntem ve değerlendirme: Toplam hacim 60 µl olacak şekilde PCR gerçekleştirildi.

PCR karışımı: 10x PCR tamponu : 6 μl

MgCl2 : 2.4 μl

Primer BD1 : 1.2 μl Primer 4S : 1.2 μl

Taq DNA polimeraz : 0.25 μl

genomik DNA : 100 ng Distile su ile 60 μl’ye tamamlandı.

Amplifikasyon: Ribozomal DNA ITS1 gen bölgesini çoğaltmak amacıyla termal döngü cihazı şu şekilde programlandı:

95 ˚C’de 2 dakika ön denatürasyon 95 ˚C’de 1 dakika denatürasyon

52 ˚C’de 1 dakika bağlanma 35 döngü 72 ˚C’de 1 dakika sentez

72 ˚C’de 5 dakika son uzama

Tüm PCR uygulamalarında; pozitif kontrol olarak Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji AD’nda görevli Doç.Dr. Sami ŞİMŞEK’ten temin edilen evcil koyun suşu DNA’sı ve negatif kontrol olarak steril distile su kullanıldı.

Elektroforez ve değerlendirme: 10 μl PCR ürünü ile 2 μl yükleme boyası karıştırılıp %1,5’luk agaroz jelde kuyulara yüklendi. Elektroforez tampon solüsyonu olarak 0.5x TBE kullanıldı ve elektroforez cihazında 90 voltta 1 saat süresince yürütüldü. UV ışığı altında DNA boyut markırı ve pozitif kontrole göre uygun yerde bant görülen örnekler çalışmanın devamında kullanıldı.

Kesim: ITS1 bölgesi çoğalan örnekler AluI, RsaI, MspI ve HhaI enzimleri ile kesim işlemine tabi tutuldu. Reaksiyon içeriği şu şekilde idi:

PCR ürünü : 10 μl

10x restriksiyon tamponu : 2 μl Restriksiyon enzimi : 5 U

Steril distile su ile 20 µl’ye tamamlandı. 16 saat boyunca 37 ˚C’de inkübe edildi. Elektroforez ve değerlendirme: İnkübasyon sonunda ürünler %3’lük agaroz jele yüklendi. Agaroz jelde ilk kuyuya 5 µl DNA boyut markırı yüklendi. 90 voltta 1.5 saat süresince elektroforez işlemi uygulandı. Bu süre sonunda agaroz jel UV ışıkta incelenerek

örneklerin bant paternleri ile evcil koyun suşu kontrol izolatının (patern I) sergilediği bant paternleri karşılaştırıldı. Farklı bant paternlerine numara verildi (patern II, III gibi).

Mitokondriyal NADH Dehidrogenaz Subunit 1 Gen Bölgesi Kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi Yönteminin Uygulanması

Polimeraz zincir reaksiyonu - tek sarmal konformasyon polimorfizmi analizi (58,122,123) ve gümüş boyama (124,125) için önceden tanımlanan yöntemler modifiye edilerek uygulandı.

A. Kullanılan kimyasallar:

1. 2 mM deoksiribonükleozid trifosfat karışımı: Her bir deoksiribonükleozid trifosfat (dNTP, 100 mM; Bioron, Almanya)’tan 2 μl alınıp 92 μl distile su ile karıştırıldı.

2. 0.5x TBE tampon solüsyonu: 10x TRIS borate–EDTA buffer solüsyon (Sigma, ABD) distile su ile 1/20 oranında sulandırıldı.

3. Primerler: MS1 ve MS2 (Integrated DNA Technologies, Belçika) primerleri önce her biri için belirtilen nmol değerlerine göre 100 μM olacak şekilde distile su ile sulandırıldı. Ardından distile su ile 1/4 oranında sulandırılarak 25 μM’lık konsantrasyon elde edildi.

4. 10x PCR tamponu (Fermentas, Litvanya): KCl : 500 mM

Tris HCl pH:8.8 : 100 mM

Nonidet P40 : %0.8

5. %2 agaroz jel: 1 g agaroz (Sigma, ABD) 0.5x TBE tampon solüsyonu ile 50 ml’ye tamamlandı. Karışım; mikrodalga fırında kaynatıldı, soğuması için bir süre bekletildi, sonra içine 2.5 µl etidyum bromid (10 mg/ml, Sigma, ABD) eklendi.

6. 1.5 M Tris pH:8.8: 18.17 g Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 90 ml’ye tamamlandı. pH 8.8’e ayarlandıktan sonra distile su ile 100 ml’ye tamamlandı.

7. 1 M Tris pH:6.8: 6.05 g Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 40 ml’ye tamamlandı. pH 6.8’e ayarlandıktan sonra distile su ile 50 ml’ye tamamlandı.

8. %30 akrilamid/bisakrilamid: 30 g Acrylamide:N,N′-Methylenebisacrylamide 29:1 (Fluka, ABD) distile su ile 100 ml’ye tamamlandı.

9. %10 amonyum persülfat: 1g Ammonium persulfate (Sigma, ABD) distile su ile 10 ml’ye tamamlandı.

10. 1 M NaOH: 0.4 g Sodium hydroxide (Riedel-de Haën, ABD) distile su ile 10 ml’ye tamamlandı.

11. %2.5 bromfenol mavisi: 0.25 g Bromophenol Blue (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 10 ml’ye tamamlandı.

12. %2.5 ksilen siyanol: 0.25 g Xylene Cyanol FF (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 10 ml’ye tamamlandı.

13. Denatürasyon tamponu: 10 µl 1 M NaOH, 20 µl %2.5 bromfenol mavisi, 20 µl %2.5 ksilen siyanol 950 µl formamid (Sigma Aldrich, ABD)’e eklendi.

14. %10 etanol + %5 asetik asit: 25 ml saf etanol ile 12.5 ml asetik asit (Sigma- Aldrich, ABD) distile su ile 250 ml’ye tamamlandı.

15. %0.1 gümüş nitrat solüsyonu: 0.25 gr gümüş nitrat (Sigma-Aldrich, ABD) önce bir miktar distile suda çözüldü, ardından distile su ile 250 ml’ye tamamlandı.

16. %1.5 sodyum hidroksit solüsyonu: 3.75 g NaOH (Riedel-de Haën, ABD) önce bir miktar distile suda çözüldü ardından distile su ile 250 ml’ye tamamlandı.

17. %0.75 sodyum karbonat solüsyonu: 1.875 g Na2CO3 (Riedel-de Haën, ABD) önce

bir miktar distile suda çözüldü ardından distile su ile 250 ml’ye tamamlandı. 18. Taq DNA polimeraz, 5U/µl (Fermentas, Litvanya)

19. 25 mM MgCl2 (Fermentas, Litvanya)

20. Gliserol (Sigma, ABD)

21. TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine; Sigma, ABD) 22. Etil alkol absolut (Sigma, ABD)

23. Formaldehit solüsyonu (≥%36; Sigma, ABD)

24. Deoksiribonükleik asit boyut markırı (Q’RangeRuler 100 bp DNA Ladder; Fermentas, Litvanya)

25. 6x yükleme boyası (Sigma, ABD)

26. Deoksiribonükleik asit boyut markırı (BenchTop pGEM DNA Markers; Promega, ABD)

B. Yöntem ve değerlendirme: Toplam hacim 50 µl olacak şekilde PCR