A B M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı

izolatı; 5: Koyun izolatı; 6: Negatif kontrol.

Şekil 9. Echinococcus granulosus’un insan, sığır ve koyun izolatlarının mitokondriyal NADH dehidrogenaz subunit 1 bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılması sonucunda oluşan bantlar

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4

A B M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı

Şekil 10. Echinococcus granulosus izolatlarının mitokondriyal NADH dehidrogenaz subunit 1 bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu – tek sarmal konformasyon polimorfizmi analizi sonucunda elde edilen bantlar: A-Genotip 1 kontrol suşu (1), genotip 7 kontrol suşu (2), patern A (3,4,5,6,7) ve patern B (8), B-Genotip 1 kontrol suşu (1), patern A (2,3), patern C (4)

400 bp 2645 bp 1605 bp 1198 bp 1198 bp 1605 bp 2645 bp

Deoksiribonükleik Asit Dizi Analizi

Polimeraz zincir reaksiyonu - RFLP yöntemi ve PCR-SSCP yöntemi ile G1 ve G7 kontrol suşlarına ait bant paternlerinden farklı örnekler arasından rastgele seçilen 8 izolat ve kontrol suşları ile aynı paterni sergileyen örneklerden rastgele seçilen 5 izolatın mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgeleri amplifiye edildi.

Mitokondriyal CO1 gen bölgesinin JB3 ve JB4.5 primerleri ile çoğaltılması sonucunda yaklaşık 450 bp, mitokondriyal ND1 gen bölgesinin MS1 ve MS2 primerleri ile çoğaltılması sonucunda yaklaşık 400 bp büyüklüğünde bant elde edildi. Şekil 11’de pozitif kontrol ve örneklere ait mitokondriyal CO1 gen bölgesinin elektroforez sonrası elde edilen bant profilleri görülmektedir.

Çoğaltılan ve saflaştırılan 13 izolata ait parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 PCR ürünleri Refgen (Ankara, Türkiye) firmasına gönderilerek çift yönlü DNA dizi analizi yaptırıldı. Dizi analizi sonuçlarının referans dizilerle karşılaştırılması sonucunda Edirne ilinden bir izolatın (insan) G7 suşuna, diğer 12 izolatın G1 suşuna ait olduğu belirlendi.

M 1 2 3 4 5

M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı (100 bp); 1: Pozitif kontrol; 2: İnsan izolatı; 3: Sığır izolatı; 4: Koyun izolatı; 5: Negatif kontrol.

Şekil 11. E. granulosus’un insan, sığır ve koyun izolatlarının mitokondriyal sitokrom oksidaz c subunit 1 bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılması sonucunda oluşan bantlar

Dizi analizi sonucunda parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgeleri birlikte değerlendirildiğinde 8 haplotipin bulunduğu tespit edildi ve Iontek (İstanbul, Türkiye)

500 bp 400 bp

firmasına bu haplotiplerin filogenetik analizi yaptırıldı. Örneklerimize ait parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 dizileri GenBank veri tabanına kayıt edildi (Ek 4-13).

Referans diziler ve çalışmamızda elde edilen haplotiplerin filogenetik analizi sonucu elde edilen dendrogram Şekil 12’de gösterilmektedir Dizi analizine gönderilen örnekler ve genotipleri Tablo 5’de; haplotipler ve GenBank erişim numaraları Tablo 6’da gösterilmektedir..

G: Referans diziler, H: Çalışmada elde edilen haplotiplere ait diziler

Şekil 12. Referans diziler ve çalışmamızda elde edilen haplotiplerin filogenetik analizi sonucu elde edilen dendrogram

Echinococcus granulosus Genotip 1 - Genotip 3 kompleksi Genotip 6 - Genotip 10 kompleksi

Tablo 5. Dizi analizine gönderilen örnekler ve genotipleri Analiz no İzolat no Konak PCR- RFLP paterni PCR- SSCP paterni Dizi analizi Genotip/ Haplotip CO1 ND1 1 4 İnsan I A G1 G1 (195C/T) G1/H1 2 5 İnsan III B G7 G7 (3A/G) G7/H2 3 10 İnsan I C G1 G1 (195C/T, 288 T/C) G1/H3 4 16 İnsan I A G1 (56C/T) G1 G1/H4 5 19 İnsan I A G1 (56C/T) G1 (195C/T) G1/H5 6 25 İnsan II A G1 (108T/C) G1 (195C/T) G1/H6 7 28 İnsan II A G1 (108T/C) G1 (195C/T) G1/H6 8 29 İnsan II A G1 (108T/C) G1 (195C/T) G1/H6 9 30 İnsan II A G1 (108T/C) G1 (195C/T) G1/H6 10 34 İnsan II A G1 (108T/C) G1 (195C/T) G1/H6 11 44 Sığır I A G1 G1 (195C/T) G1/H1 12 45 Koyun I A G1 (66C/T, 306G/A) G1 (195C/T) G1/H7 13 54 Sığır I A G1 (66C/T) G1 (195C/T) G1/H8 PCR-RFLP: ‘‘Polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism’’; PCR-SSCP:

‘‘Polymerase chain reaction - single stranded conformation polymorphism’’; CO1: Sitokrom oksidaz c subunit 1; ND1: NADH dehidrogenaz subunit 1; G: Genotip; C:Sitozin; T: Timin; G: Guanin; A: Adenin; H: Haplotip.

Tablo 6. Haplotipler ve GenBank erişim numaraları

Haplotip Konak (sayı) Erişim no (CO1) Erişim no (ND1) Haplotip 1 İnsan (1), sığır (1) HQ717150 HQ717151 Haplotip 2 İnsan (1) HQ717155 HQ717154 Haplotip 3 İnsan (1) HQ717150 HQ717152 Haplotip 4 İnsan (1) HQ717148 HQ717153 Haplotip 5 İnsan (1) HQ717148 HQ717151 Haplotip 6 İnsan (5) HQ703429 HQ717151 Haplotip 7 Koyun (1) HQ717149 HQ717151 Haplotip 8 Sığır (1) HQ717156 HQ717151

TARTIŞMA

Echinococcus cinsi parazitler tüm dünyada oldukça yaygın olup, insanlarda ciddi

zoonotik enfeksiyonlara yol açmaları nedeniyle tıbbi olarak ve halk sağlığı açısından çok önemli sestodlardır. Echinococcus cinsinin dört türü bulunmakta olup bunlardan E.

granulosus türü içinde de önemli suş varyasyonları bulunmaktadır. Her bir türün kesin konağı

bir etçil iken ara konak birçok memeli türünden biri olabilir. Parazitin larval döneminin neden olduğu KE ara konaklarda patojenik ve ekonomik açıdan oldukça önemlidir. Bazı türler sınırlı coğrafik dağılıma sahip olsa da Echinococcus cinsi tüm dünyada bulunur (19,20).

Çalışmaya dahil edilen insanlardaki 42 hidatik kistin 20’si (%47.6) karaciğer; 19’u (%45.2) akciğer lokalizasyonlu idi. Sığırlardaki hidatik kistlerin ise 9’u (%69.2) karaciğer; 4’ü (%30.8) akciğer lokalizasyonlu idi. İnsanlarda diğer çalışmalarda (54,81,82,133) belirtildiği gibi ilk sıklıkta karaciğer lokalizasyonu, ikinci sıklıkta akciğer tutulumu olduğu görülmüştür. Sığırlarda saptanan organ lokalizasyon oranının bazı çalışmalarla uyumlu (134,135); bazı çalışmalarla (86,136) uyumsuz olduğu görülmüştür.

Hidatik kistlerde fertilite E. granulosus döngüsünün stabilitesini etkileyen önemli bir faktördür. Kistler; coğrafik durum, enfekte konağın cinsi, kistlerin yeri, boyutu ve tipine göre farklı fertilite oranlarına sahip olabilirler (137). Duyarlı ara konakların çok olduğu endemik bölgelerde parazitin fertil kist üretmesi ya o bölgede bulunan suşun geniş bir konak dağılımına sahip olduğunu ya da o bölgede birden fazla suşun bulunduğunu gösterir (6). KE’te protoskolekslerin canlılığının belirlenmesi çeşitli in vivo ve in vitro çalışmalarda ve ilaç deneylerinde önemlidir (138-144).

Manterola ve ark. (145) insanlardaki karaciğer hidatik kistlerde fertilite oranını %57.1, bu kistlerdeki protoskolekslerin canlılık oranını ise %42 olarak belirlemişlerdir. Esfandiari ve

Youssefi (146) koyunlardaki canlı protoskoleks oranını eozin boyama ile akciğerlerde %88, karaciğerde %93; trypan blue boyama ile akciğerlerde %82, karaciğerde %95 olarak saptamışlardır. Sığırlardaki canlı protoskoleks oranını ise eozin boyama ile akciğerlerde %69, karaciğerde %82, trypan blue boyama ile akciğerlerde %65, karaciğerde %76 olarak tespit etmişlerdir. Dalimi ve ark. (137) koyunlardaki canlı protoskoleks oranını akciğerlerde %25.2, karaciğerde %36.9; sığırlardaki canlı protoskoleks oranını akciğerlerde %14.1, karaciğerde %10.2 olarak saptamışlardır. Yıldırım ve ark. (147) koyunlarda karaciğerde fertil kist oranını % 30.1; kalsifiye kist oranını %35.9; kazeifiye kist oranını ise %6.8 olarak saptamışlardır. Koyunlardaki canlı protoskoleks oranını metilen mavisi ile boyama sonucu %68.8, trypan blue boyama ile %71.5, eozin boyama ile %67.1 olarak bulmuşlardır.

Yaptığımız bu çalışmada insanlarda fertil kist oranı karaciğerde %95, akciğerlerde %26.3; sığırlarda fertil kist oranı karaciğerde %11.1 olarak bulundu, akciğerlerde fertil kiste rastlanmadı. Koyundan elde edilen 3 adet kistin de fertil olduğu belirlendi. Çalışmamızda; insanlarda canlı protoskoleks oranı karaciğerde %7.1 (1/14), akciğerde %40 (2/5) olarak bulunurken, koyuna ait kistlerin %100’ünün (3/3) canlı protoskoleks içerdiği tespit edildi.

Çalışmamızdaki koyun hidatik kist sayısı az olmasına karşın; fertilite oranının koyunlarda sığırlara göre oldukça yüksek olarak saptanması ve akciğer lokalizasyonlu kistlerde yüksek protoskoleks canlılık oranlarının diğer çalışmalar (146-149) ile uyumlu olduğu görülmüştür. İnsan kaynaklı kistlerde protoskoleks canlılık oranının Manterola ve ark.’nın (145) yaptıkları çalışma ile uyumsuz olduğu belirlenmiştir. Bizdeki düşük canlılık oranı nedeninin insanlarda operasyon öncesi/sırasında ilaç kullanımı olduğunu düşünmekteyiz.

Polimeraz zincir reaksiyonu – restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi yöntemi nükleer genomik rDNA ITS1 bölgesinin boyu ve dizisini kullanarak Echinococcus izolatlarının kolay ve hızlı bir şekilde ayırt edilmesine olanak verir. Ribozomal RNA (rRNA) genleri; yüksek oranda korunmuş kodlanan bölgeler ile bu bölgeler arasında nispeten zayıf olarak korunmuş kodlanmayan aralık bölgelerinin bulunduğu rDNA üniteleri içinde organize olmuşlardır. Her 4-baz kesen restriksiyon enziminin yaklaşık 1 kb uzunluğundaki ITS1 bölgesini dört kez kestiği varsayılır. Yani her enzimin 16 nükleotidi incelemesi beklenir. Örneğin beş enzimin kullanıldığı bir çalışmada ITS1 fragmentinin %8’i incelenmiş olur. Farklı tür ve suş gruplarındaki örnekler analiz edilmiş ve karakteristik RFLP paternleri ortaya konmuştur. Bu yaklaşım toplanan E. granulosus izolatlarının tanımlanması ve geçiş paternlerinin araştırılmasında hızlı ve ideal bir yöntemdir (25,43,50).

Bowles ve ark. (150) Hollanda’dan insan kökenli bir E. granulosus izolatında rDNA ITS1 bölgesinin PCR-RFLP paternlerini incelemişler ve mitokondriyal CO1 ve ND1 bölgelerinin dizi analizini yaparak bu izolatın sığır suşu olduğunu tespit etmişlerdir. Bu suşun CO1 için %8.7 ve ND1 için %13.8 oranında koyun suşu dizisinden farklı olduğunu belirtmişlerdir. Bowles ve McManus (50) çeşitli ülkelerden topladıkları E. granulosus izolatlarını AluI, RsaI, MspI, CfoI ve TaqI restriksiyon enzimlerini kullanarak rRNA ITS1 bölgesini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler, Türkiye’den iki izolatı da koyun suşu olarak belirlemişlerdir.

Yine Maravilla ve ark. (151) Meksika’lı bir hastadan elde edilen kist materyalinin RAPD, PCR-RFLP ve mitokondriyal CO1 gen analizi ile identifikasyonu sonucunda sığır suşu olduğunu belirlemişlerdir. Wachira ve ark. (35) Kenya’da iki farklı bölgeden topladıkları larval ve erişkin E. granulosus örneklerini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler, önceki çalışmalar ile uyumlu olarak bu bölgelerde E. granulosus’un koyun ve deve suşlarının varlığını göstermişler, keçi ve sığırda deve suşu tespit etmişlerdir.

Scott ve ark. (152) Polonya’da insan ve domuzlardan elde ettikleri E. granulosus izolatlarını tanımlamak için ribozomal ITS1 bölgesini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler: insanlardan elde ettikleri izolatların farklı ITS1-RFLP paterni sergilediğini ve mitokondriyal ND1 dizisinde farklılıklar olduğunu tespit etmişlerdir. Bu izolatların daha önce tanımlanmamış, yeni bir genotipik grup (G9) olduklarını ifade etmişlerdir. Rosenzvit ve ark. (36) Arjantin’de farklı bölge ve konaklardan topladıkları E. granulosus izolatlarını tanımlamak için RsaI, CfoI ve HpaII enzimlerini kullanarak PCR-RFLP analizi ile mitokondriyal CO1 ve ND1 gen dizilemesi yapmışlar; bu bölgelerde G1, G2, G6 ve G7 genotiplerinin bulunduğunu göstermişlerdir. Ancak PCR-RFLP yönteminin ile G1 ve G2 genotipleri ile G6 ve G7 genotipleri arasındaki ayırımı göstermediğini tespit etmişlerdir. Bu çalışma ile ilk kez insanda G2 ve G6 genotiplerinin varlığını rapor etmişlerdir.

Zhang ve ark. (153) İran’da insan, koyun, keçi, sığır ve develerden topladıkları E.

granulosus izolatlarının mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizini; BfaI

enzimi kullanılarak mitokondriyal ND1 bölgesinin PCR-RFLP analizini yapmışlardır. Sonuçta deve izolatlarının G6, diğer izolatların G1 genotipinde olduklarını saptamışlardır. Harandi ve ark.’nın (33) İran’da farklı coğrafik bölgelerden topladıkları insan, koyun, sığır ve deve kökenli E. granulosus izolatlarını AluI, HhaI, MspI, RsaI ve TaqI enzimlerini kullandıklarak PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler; insanlarda deve suşunun varlığını göstermişlerdir.

İran’ın Tebriz bölgesinde kesimhanelerden toplanan koyun ve sığır hidatik kistleri ile hastanelerden elde edilen insan izolatlarının ITS1 fragmentleri RsaI ve HpaII enzimleri ile

kesime uğratılmıştır. Tüm izolatlarda benzer olarak, RsaI ile kesim sonucunda yaklaşık 600 bp ve 300 bp uzunluğunda iki bant; HpaII ile kesim sonucunda yaklaşık 600 bp ve 200 bp uzunluğunda bantlar elde edilmiştir. İzolatların tamamının E. granulosus’un o bölgede baskın genotipi olan koyun suşu olabileceği belirtilmiştir (154). Shartbatkhori ve ark. (155) İran’da koyun, keçi, sığır ve develerden elde ettikleri 112 E. granulosus izolatını AluI enzimini kullanarak PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler; 106 izolatı G1, 6 izolatı G6 olarak belirlemişlerdir. İran’da yapılan başka bir çalışmada; insan, koyun ve develerden elde edilen

E. granulosus izolatlarının ITS1 bölgesinin AluI, HpaII, RsaI ve TaqI enzimleri ile kesimi

sonucunda, insan ve koyun kökenli izolatlar ile deve kökenli izolatların farklı RFLP paternleri sergiledikleri gözlenmiştir (34).

Lavikainen ve ark. (130) Finlandiya’nın kuzeydoğusunda dört ren geyiği ve bir fareden topladıkları beş E. granulosus izolatının rDNA ITS1 bölgesi ile mitokondriyal CO1 ve ND1 bölgelerinin dizi analizi sonucunda Fennoscandian geyik suşu olarak isimlendirilen yeni bir genotip tanımlamışlardır. Dinkel ve ark. (45) Kenya ve Sudan’da insan, deve, koyun, keçi, domuz, sığırlardan ve elde ettikleri E. granulosus izolatlarını PCR, PCR-RFLP ve dizi analizi yöntemleriyle incelemişlerdir. Analizler sonucunda insanlarda, develerde ve koyunlarda G1 ve G6, keçilerde G6, domuzlarda G1, G6 ve E. ortleppi (G5), sığırlarda G6 genotipi ve E.

ortleppi tespit edilmiştir. Bu çalışma ile Afrika’nın doğusundaki insanlarda ilk kez deve suşu

(G6) ile enfeksiyon belirlenmiş, Kenya ve Sudan’daki çiftlik hayvanlarında ilk kez E. ortleppi rapor edilmiştir.

M’rad ve ark. (156) Tunus’ta insan, sığır, koyun ve develerden elde ettikleri fertil kist materyallerinin rDNA ITS1 bölgesini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişlerdir. CfoI ve HpaII ile kesim sonrasında deve izolatlarında G6, diğer izolatlarda G1 paternini gözlemlemişlerdir. G1 paterni sergileyen izolatların mitokondriyal CO1 bölgesinin dizi analizi sonucunda bazı izolatlarda C56T, T123C, G312A veya T204G mutasyon varlığını tespit etmişlerdir. Varsacia ve ark (157) Sardunya’da koyun, sığır ve domuzlardan elde ettiği E. granulosus izolatlarını PCR, PCR-RFLP ve mitokondriyal CO1 ve ND1 dizi analizi yöntemleri ile incelemişlerdir. PCR ile domuz izolatlarından 2’sinin G6/7, 89 izolatın G1; PCR-RFLP ve dizi analizi ile de 2 izolatın G7, diğerlerinin G1 genotipinde olduğunu saptamışlardır.

Utuk ve ark. (10) yaptığı Elazığ, Malatya, Erzurum, Van, Diyarbakır ve Şanlıurfa illerinden toplanan 179 koyun, 19 sığır, 7 keçi, 1 deve, 1 köpek ve 1 insan izolatını içeren bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada sığır, koyun ve keçi izolatları CfoI, MspI, RsaI ve AluI restriksiyon enzimlerinin kullanıldığı PCR-RFLP yöntemleri ile incelenmiş, tüm izolatlar benzer paternleri sergilemiştir. Rastgele seçilen 6 sığır, 4 koyun, 4 keçi ve 1 deve, 1 köpek, 1

insan izolatının mitokondriyal CO1 gen bölgesinin dizi analizi sonucunda 17 izolat da E.

granulosus’un G1 suşu olarak identifiye edilmiştir.

Çalışmamızda 42 insan, 13 sığır ve 3 koyun izolatının rDNA ITS1 gen bölgesi HhaI,

MspI, RsaI ve AluI restriksiyon enzimleri kullanılarak PCR-RFLP yöntemi ile incelenmiştir.

Yapılan analizler sonucunda G1 kontrol suşundan farklı 2 patern (patern II ve patern III) gözlenmiştir. Buna göre; 47 izolatın G1 kontrol suşu (patern I) ile aynı bant paternine sahip olduğu, pozitif kontrolden farklı olduğu gözlenen 10 izolatın patern II’yi; 1 adet izolatın ise patern III’ü sergilediği belirlendi. Farklı patern sergileyen örneklerin parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda; patern II’nin G1, patern III’ün G7 suşuna ait olduğu tespit edildi. Çalışmamızın diğer çalışmalar gibi (33,35,50,150,152,155,156)

E. granulosus genotiplerini ayırabildiği gözlemlendi.

Tek zincir konformasyon polimorfizmi DNA fragmentlerinde dizi benzerliği olup olmadığını taramak için basit, ucuz ve duyarlı ve ihtiyaç duyulan dizileme miktarını önemli oranda azaltabilen bir yöntemdir (158). SSCP özel donanım gerektirmeyen, uygulaması nispeten kolay, radyoaktif olmayan mutasyon tarama yöntemlerine uygun ve çeşitli elektroforetik şartlara uyum sağlayabilen bir tekniktir. Bu yöntemin en önemli dezavantajı deneyim gerektiren bir teknik olmasıdır. Çok sayıda bant içeren jellerin yorumlanması zor olabilir. Sonuçta, SSCP mutasyonların hemen hemen %100’ünü saptayabilir fakat çeşitli elektroforetik şartlara gereksinim duyabilir (122).

Gasser ve ark. (58) E. granulosus’un G1, G4, G6, G8 genotipleri ile E. multilocularis,

E. oligarthrus ve E. vogeli genotiplerini kullanarak enzimatik olarak çoğalttıkları

mitokondriyal CO1 ve ND1 bölgelerinin SSCP analizini geliştirmişlerdir. Bu çalışma sonucunda, DNA dizileme veya restriksiyon analizlerine gerek duyulmadan Echinococcus’un mitokondriyal DNA dizi varyasyonlarının direkt olarak gösterilmesinde SSCP’nin yararlı olduğunu göstermişlerdir. Zhang ve ark. (159) Arjantin ve Çin’den insan, domuz, koyun, deve ve yaklardan topladıkları E. granulosus izolatlarının CO1 ve ND1 fragmentlerini SSCP yöntemi ile incelemiş, farklı patern gösteren izolatların dizi analizini yapmış ve sonuçta G1, G2, G6, G7 genotiplerini tespit etmiştir.

Sharbatkhori ve ark. (127) İran’daki çeşitli ara konaklardan topladıkları E. granulosus izolatlarının mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerini kullanarak PCR temelli SSCP analizi ile bu izolatların karakterizasyonu ve genetik ilişkilerini incelemişlerdir. PCR-SSCP analizinde elektroforetik profillerine göre parsiyel mitokondriyal CO1 gen bölgesi için 5, parsiyel mitokondriyal ND1 gen bölgesi için 9 farklı profil gözlemlemişler ve her bir profili sergileyen birer amplikonun dizi analizini yapmışlardır. Dizi analizi sonucunda 148 örneğin

142’sinin E. granulosus’un G1-G3 kompleksi (E. granulosus sensu stricto), 6’sının G6-G10 kompleksi (E. canadensis)’ne ait olduğunu tespit etmişler; PCR-SSCP’nin tek nokta mutasyonlarını kolayca saptayabildiğini belirtmişlerdir.

Abushhewa ve ark. (160) Libya’da insan, sığır ve develerden elde ettikleri toplam 176 izolatın mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerini PCR-SSCP yöntemi ile incelemişler; her iki bölge için 4’er farklı elektroforetik patern saptamışlardır. Jabbar ve ark. (161) Moğolistan’da insanlardan elde ettikleri 50 hidatik kist materyalinin mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerini PCR-SSCP yöntemi ile incelemişler; her iki bölge için 4’er farklı elektroforetik patern saptamışlardır.

Çalışmamızda; izolatların mitokondriyal ND1 gen bölgesinin PCR-SSCP analizi yapılarak G1 ve G7 kontrol suşları ile karşılaştırıldı ve üç farklı bant paterni tespit edildi. İzolatların 56’sı patern A’yı (G1 kontrol suşu ile uyumlu), 1’i patern B’yi (G7 kontrol suşu ile uyumlu), 1’i patern C’yi sergiledi. Farklı patern sergileyen örneklerin parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda; patern B’nin G7, patern C’nin G1 suşuna ait olduğu tespit edildi.

Organizmalar arasında belirli DNA segmentlerinin nükleotid dizilerinin karşılaştırması genetik varyasyonun saptanmasında en direkt ve duyarlı araçtır. Mitokondriyal DNA; nisbeten hızlı gelişim oranı nedeniyle yakın ilişkili organizmaların ayrımı için kullanışlıdır. Ayrıca mitokondriyal DNA maternal geçişli olduğundan ve rekombine olmadığından analizi daha basittir (162). Özellikle mitokondriyal protein kodlayan genler CO1 ve ND1 E. granulosus suş identifikasyonu için çok değerlidir. (43). Genel olarak, ND1 geni CO1 geninden daha değişkendir. Echinococcus türleri arasındaki ND1 gen dizi farklılığı %12.7-16.3; suşlar arasında %6.8-14.9’dur. Echinococcus türleri arasındaki CO1 gen dizi farklılığı %6.0-11.5; suşlar arasında %4.6-9.3’tür (131). Mitokondriyal CO1 ve ND1 veri setlerinin bağımsız ve birlikte analizi E. granulosus’un çeşitli suşlarının bir monofilektik gruptan oluşmadığını göstermektedir. Mitokondriyal CO1 ve ND1 verileri çeşitli grupları değerlendirmede tek başına yeterli olmayıp nükleer ITS1 bölgesinden de veriler elde edilmelidir (25). Günümüzde

Echinococcus popülasyonlarının filogenetik analizi için mitokondriyal DNA CO1, ND1 ve

adenozin trifosfat 6 (ATP6) genleri ile nükleer rDNA ITS1 genleri kullanılmaktadır (41). Bowles ve ark. (126) 56 Echinococcus izolatının mitokondriyal CO1 gen bölgesini dizileyerek 4 Echinococcus türünün net bir şekilde ayırımını yapıp E. granulosus içinde 7, E.

multilocularis içinde 2 genotip saptamışlardır. Santivanez ve ark. (163) Peru’da suş ayırımını

yapmak amacıyla 21 insan materyali toplamışlar, 20 örneğin mitokondriyal CO1 gen bölgesini çoğaltıp dizi analizi yapmışlardır. Analiz sonucunda 19 izolatın G1, 1 izolatın G6 suşu

olduğunu belirlemişlerdir. Güney Brezilya’da 28 sığır ve 12 koyundan elde edilen E.

granulosus izolatı PCR ile G1 ve G5 olarak tespit edilmiş, ardından doğrulama amacıyla

parsiyel mitokondriyal CO1 dizi analizi yapılmıştır. Analizler sonucunda 38 izolat G1, 2 sığır izolatı G5 olarak bulunmuştur (164).

Latif ve ark. (30) Pakistan’da insan ve çiftlik hayvanlarından elde ettikleri kist materyallerinin CO1 gen bölgesini dizileyerek filogenetik analizini yapmışlardır. Bu analizler sonucunda çiftlik hayvanlarında G1 ve G3, iki insan örneğinde ise G1 suşu tespit edilmiştir. Bhattacharya ve ark. (165) Hindistan’da koyun, sığır ve manda izolatlarını içeren; ITS1 ile mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizinin yapıldığı çalışmada E.

granulosus’un G2 genotipini manda ve koyunlarda tespit etmişlerdir. Bu çalışma, mandada

G2 genotipinin varlığını gösteren ilk rapordur. Bir başka çalışmada Bart ve ark. (37) mitokondriyal CO1 bölgesi dizi analizi sonucunda Çin’de ilk kez hastalarda G6 genotipini saptamışlardır.

Lavikainen ve ark. (166) Finlandiya ve İsveç’teki 33 geyik izolatı (ren geyiği ve mus) mitokondriyal ND1 gen dizi analizi ile karakterize edilmiştir. Buna ek olarak mitokondriyal ATP6, ND1, ND3 ve CO1 genleri kullanılarak E. granulosus suşlarının filogenetik analizi yapılmıştır. Filogenetik analizde G6, G7, G8 ve G10 suşları bir monofiletik grupta kümelenmiş; G1 ve G4 suşlarından net bir şekilde ayrılmış; G5 suşu ile yakın ilişkili bulunmuştur. Bu sonuçlar G6-10 genotiplerinin E. granulosus sensu stricto türlerinden ayrı olduğunu belirten önceki çalışmaları desteklemektedir.

Capuano ve ark. (31) İtalya’nın güney kesiminde 48 mandadan elde edilen hidatik kist materyalinin mitokondriyal CO1 gen bölgesinin dizi analizini yapmışlar; 33 örneği evcil koyun suşu (G1), 15 izolatı manda suşu (G3) olarak tespit etmişlerdir. Bart ve ark. (28) nükleer BG1/3 ile mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda Romanya’nın çeşitli bölgelerinden topladıkları E. granulosus izolatlarının G1, G2 ve G7 genotipinde olduğunu belirlemişlerdir. Bu çalışma ile ilk kez sığırda Tazmanya koyun suşunun varlığı tespit edilmiştir.

Varsacia ve ark. (32) Yunanistan’da 20 koyun ve 20 keçiden topladıkları hidatik kist materyallerinin G1, G5 ve G6/G7 suş ayırımı için PCR/ seminested PCR uygulamışlar; özgül moleküler tanı için ise mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgesini çoğaltıp dizi analizi yapmışlardır. Analizler sonucunda 18 koyunun G1, 2 koyunun G3 ve keçilerin tamamının G7 suşu ile enfekte olduğu tespit edilmiştir. Breyer ve ark. (167) Bulgaristan’da sığır, koyun, domuz, çakal ve kurtlardan elde edilen 24 E. granulosus izolatının nükleer ActII ve AgB1 gen bölgeleri ile mitokondriyal ND1 ve Hbx2 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda izolatların

tamamının G1 genotipinde olduğunu belirlemişlerdir. Mitokondriyal ND1 dizi analizi sonucunda domuz izolatlarında 376. pozisyonda T/C baz değişimi saptanmasına karşın bu veri epidemiyolojik açıdan önemli kabul edilmemiştir.