Düşük Fiyatlandırma İle İlgili Literatür Çalışmaları

A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e representa um importante problema de saúde pública em regiões endêmicas. O agente causador da doença de Chagas infecta mais de 18 milhões de pessoas a cada ano na América do Sul (Morel, 2000) e resulta em mais de 50.000 mortes a cada ano (Higuchi, 1995).

As opções de tratamento são limitadas ainda, devido à toxicidade dos fármacos disponíveis, resistência do parasita e atividade de drogas ineficiente durante a fase crônica da doença (Astelbauer et al., 2010). Nifurtimox e benzonidazol são usados para tratar a fase aguda da doença de Chagas, porém provocam efeitos colaterais tóxicos (Freymann et al., 2000). Nifurtimox provoca anorexia, distúrbios gastrintestinais, neuropatias e erupção cutânea (Berger et al., 1998).

O T. cruzi é um parasito dotado de grande diversidade genética. De modo geral, os clones e populações estudados têm sido diferenciados, mediante estudos de perfil molecular e isoenzimático em três grupos ou linhagens. Os grupos GI e GIII são basicamente de origem silvestre e vinculados naturalmente a marsupiais. O grupo Z2 é encontrado na América do Sul, ligado naturalmente a primatas (Miles, 1999; Zingales et al., 1999; Souza, 2000).

O protozoário é digenético, polifilético e distribuído largamente na natureza. A circulação de seus espécimes ocorria primitivamente entre insetos vetores e mamíferos silvestres há 150 milhões de anos (Triatominae, Hemíptera, Reduviidae) (Hoare, 1972; Brener, 1979; Gonzáles & Duarte, 1994). A transmissão do T. cruzi por via oral (VO) tem caráter habitual em seu ciclo enzoótico primitivo, através da ingestão por mamíferos suscetíveis a vetores e reservatórios infectados. No caso do ser humano, a transmissão ocorre de maneira esporádica e circunstancial, através de alimentos contaminados com o parasita, principalmente a partir de triatomíneos ou de suas dejeções (Dias, 2000; WHO, 2002; Carlier et al., 2002). A transmissão pode ocorrer também através da ingestão de carne de caça crua ou mal cozida, ingestão de alimentos contaminados por urina ou secreção anal de marsupiais infectados, por

acidentes em laboratório ou por meio de hábitos primitivos de ingestão de triatomíneos (Amado-Neto et al., 1975; Deane et al., 1984; Dias & Macedo, 2005; Storino & Jorg, 1994).

T. cruzi possui um ciclo de vida complexo, exibindo formas morfológicas e funcionais

bastante distintas. Estas classificam-se em duas fases: epimastigotas (no inseto vetor) e amastigotas (em células de mamíferos). Além disso, são classificados em duas formas infectantes, mas não replicativas, tripomastigotas metacíclicos (no inseto vetor) e tripomastigotas na circulação sanguínea de mamíferos (Cabral et al., 2010).

As plantas medicinais podem ser uma alternativa no tratamento da doença de Chagas, sendo uma fonte de novos fármacos com alta atividade e baixa toxicidade. Por exemplo, o lupeol inibe de forma significativa o crescimento de T. cruzi e Leishmania (Siddique & Saleem, 2011; Fournet et al., 1992). O ácido betulínico mostra atividade tripanocida expressiva (75,4% na concentração de 500 µg/mL) (Domínguez-Carmona et al., 2010; Campos et al., 2005). Desta forma, extratos e frações de J. acuminatissima foram avaliadas contra o protozoario T. Cruzi.

5.2.2. Materiais e métodos

Os extratos foram testados por meio do ensaio colorimétrico (Buckner et al., 1996; Oliveira et al., 2006). Este ensaio utiliza uma cepa de T. cruzi (Tulahuen) transformada para expressar β-galactosidase, enzima que é capaz de catalisar uma reação colorimétrica quando um composto vermelho, clorofenil-β-D-galactopiranosídeo (CPRG), é utilizado como substrato.

Os ensaios foram realizados com formas tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi provenientes de cultura de tecido. Cerca de 4.000 células L929 por poço foram semeadas em placas de 96 poços, com incubação “overnight” em estufa a 37 °C para a adesão da célula à superfície. Após incubação, a infecção foi feita com 10 tripomastigotas provenientes de cultura de tecidos/célula. Após 2 h, o meio contendo os parasitas extracelulares foi substituído por um meio novo e a placa novamente incubada a 37 °C por 48 h. O meio de cultura foi substituído por um meio novo e por substâncias, frações e extratos naturais, conforme dispostos na Tabela 5.3 (p. 122), diluídos nas concentrações de 20 e 10 µµµµg/mL. Após

incubação a 37 °C por 96 h, foi adicionado o substrato CPRG nos poços e a placa foi incubada a 37 °C. A leitura foi realizada após 16-20 h em espectrofotômetro, utilizando um filtro de 570 nm. Concomitantemente, foram utilizados como controles positivos células não infectadas, células infectadas não tratadas e Benzonidazol a 1 µg/mL (3,81 µM). O DMSO

diluído a uma concentração final de 1% foi utilizado como controle negativo. Os resultados foram expressos como a porcentagem de redução da absorvância das amostras dispostas nos poços em comparação com a absorvância das amostras de células infectadas não tratadas dispostas também nos poços.

5.2.3. Resultados e Discussão

A Tabela 5.3 mostra os resultados de atividade tripanocida do extrato bruto, frações e substâncias isoladas de J. acuminatissima. A atividade dos compostos testados sobre as formas amastigotas e tripomastigotas de T. cruzi de cultivo celular pode ser descrita como inativa, pois houve redução mínima no crescimento do parasita. Contudo, a fração FAF pode ser considerada tóxica na concentração de 20 µg/mL. Essa fração promoveu 100% de morte das células hospedeiras do T cruzi. Porém, quando testada em concentração mais baixa (10

µg/mL), não apresentou redução nas formas amastigotas e tripomastigotas, sendo, portanto, inativa.

Tabela 5.3 Atividade tripanocida de extrato, frações e substâncias isoladas de J. acuminatissima

Os estudos envolvendo atividade contra cepas de T. cruzi não evidenciaram ação para nenhuma fração e substâncias testadas. Dos compostos apolares isolados de J.

Amostra Código Concentração

(µµµµg/mL)

% Atividade

Fração em hexano das folhas FHF 20 10

Fração em DCM das folhas FDF 20 7

Fração em AcOEt das folhas FAF 20

10

Tóxico 0

Fração em MeOH das folhas FMF 20 3

Extrato em etanol a 70% das folhas EE7F 20 6

Lupeol FHG-HD14 20 0

β-sitosterol e estigamasterol

glicosilados

FAF-DA8 10 13

Fração fenólica das folhas FF 40 0

Fração alcaloídica das folhas FAL 40 0

Fração saponínica das folhas FS 40 0

Luteolina-3-O-β-xilofuranose FF4 40 0

Luteolina-7-O-rutinosídeo FF2 40 0

Benzonidazol (controle positivo) - 1 µg/mL (3,81

µM)

78

acuminatissima, apenas o lupeol possui relatos na literatura com atividade tripanocida

(Siddique & Saleem 2011; Fournet et al., 1992). Durante os ensaios realizados neste trabalho a concentração do lupeol utilizada foi menor do que a concentração utilizada nos trabalhos citados, este fato deve ser um dos fatores da inatividade do lupeol no presente trabalho. Os flavonoides testados também não mostraram atividade tripanocida. A literatura mostra que os flavonóides luteolina e vicenina-2 possuem atividade contra T. cruzi apenas na concentração de 500 µ g/mL (Saúde-Guimarães & Faria, 2007), neste trabalho os derivados de luteolina foram testados na concentração de 40 µg/mL.

5.3. Teste de atividade antimicrobiana