3.6. AYNI PARTĠ BÜYÜKġEHĠR BELEDĠYE BAġKAN ADAYLARININ
3.6.2. CHP BüyükĢehir Belediye BaĢkan Adaylarının KarĢılaĢtırılması
A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com TBS-Tween 20 a 0,1% e leite em pó 5% (m/v) por 2 horas, em temperatura ambiente. Os soros dos pacientes sensibilizados foram solubilizados em TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) na diluição 1:5. Para membranas de 8 x 8 cm, foram colocados 2 mL de soro do paciente para 8 mL de TBS-Tween 20 0,1% (v/v) e leite em pó 5%. A membrana foi incubada com o soro dos pacientes a 4º durante 18 horas sob leve agitação. Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20 mL de TBS-tween 20 0,1% (v/v) por 5 vezes durante 10 minutos cada lavagem a temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo primário Biotina (marca Zymed) diluído em TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) na proporção 1:250 (100 L de Biotina e 24,9 mL de TBS-tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) por 2 horas, a temperatura ambiente. Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20 mL de TBS-tween 20 a 0,1% (v/v) por 5 vezes durante 10 minutos cada lavagem a temperatura ambiente. A membrana foi incubada com o anticorpo secundário Streptavidina (anti-IgE-HRP; marca Zymed) diluído em TBS-leite 5% (m/v) por 2 horas à temperatura ambiente, nas diluições de 1:250 [100 L do anticorpo Biotina e 24,9 mL de TBS-Tween 20 a 0,1% e leite em pó 5%(m/v)]. A membrana foi lavada com 20 mL de TBS-Tween 20 0,1% (v/v) por 10 vezes durante 10 minutos cada lavagem a temperatura ambiente. Nessa etapa, a membrana foi seca com papel filtro e posicionada numa folha de transparência de acetato, a qual foi colocada no cassete de revelação fotográfica para detecção com o Kit de imunofluorescência Enhanced Chemiluminescence (ECL) da Amersham Biosciences – GE.
A detecção com ECL consiste em um método de emissão de luz quimioluminescente para a detecção de antígenos específicos imobilizados direta ou indiretamente. Este método permite a detecção de proteínas
Capítulo 2
presentes em pequenas quantidades na amostra analisada, quando comparada com os métodos radioativos ou colorimétricos.
Na detecção, foi misturado volumes iguais da solução de detecção 1 e solução de detecção 2 permitindo volume total suficiente para cobrir as membranas. Para membranas de 8 x 8 cm, utilizamos 1 mL de cada solução de detecção, a qual foi pipetada sobre a membrana e retirado o excesso da mesma. A membrana foi incubada com filme fotográfico Hyperfilm (Amersham Biosciences – GE) no cassete de raio-X apropriado. A exposição ocorreu entre 20 segundos a 2 minutos a temperatura ambiente numa câmera escura. O filme foi removido e substituído por outro a cada tempo de exposição distinto. O filme foi revelado logo após as exposições por revelação convencional de filme fotográfico.
3.6. Espectrometria de Massas
Os experimentos de espectrometria de massas foram realizados num espectrômetro do tipo MALDI/ToF adquirido pela FAPESP, marca ETTAN (Amersham Biosciences - GE) instalado no Instituto do Coração (InCor), S.P. e em espectrômetros do tipo MALDI-TOF/TOF, marca Applied Biosciences, modelo 4000, adquiridos pela FAPERJ e instalados do Laboratório de Toxinologia Aplicada na Fundação Oswaldo Cruz (FioCruz) no Rio de Janeiro, R.J., e na Proteomics and Mass Spectrometry Facility na Cornell University – Ithaca – NY (EUA).
Inicialmente foi realizado um protocolo tentativo de identificação das proteínas por impressão digital peptídica (PMF) baseado na digestão das proteínas in gel com tripsina, seguido da medida das massas dos peptídeos trípticos resultantes. Num segundo momento, foram escolhidos os 5 picos mais intensos do espectro gerado da primeira impressão digital da proteína analisada para obter as seqüências contidas nesses fragmentos peptídicos.
As manchas de proteínas de interesse, coradas com CBB, foram recortadas do gel, descoloridas com solução de bicarbonato de amônio 25 mM pH 8,0 e acetonitrila 50% (v/v), desidratados com acetonitrila100%, sendo
Capítulo 2
então os pedaços de gel secos por centrifugação à vácuo. Em seguida, os pedaços de géis desidratados foram digeridos com tripsina, seguindo-se o protocolo: dissolveu-se 20 g de tripsina não autolítica em 900 L de tampão bicarbonato de amônio 50 mM, pH 8,0 e 100 L de ácido acético glacial. Cada pedaço de gel seco foi incubado com 20 L da solução de tripsina (0,4 g de tripsina), durante 18 horas a 37oC; a digestão foi interrompida adicionando-se 150 L de solução de acetonitrila 50% (v/v) em água destilada [contendo ácido trifluoracético a 5% (v/v)] e mantendo-se a suspensão de gel em repouso a temperatura ambiente por 30 min; em seguida, a suspensão contendo o gel foi centrifugada a 8.000 rpm por 10 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e seco por centrifugação a vácuo, sendo então mantido – 20ºC até ser analisado por espectrometria de massas.
Para a análise da amostra no espectrômetro de massas, as amostras foram reconstituídas adicionando-se 5 L de solução de acetonitrila 50% (v/v) [contendo TFA 0,5% (v/v)] e solubilizando os peptídeos gerados durante a digestão tríptica; 0,3 L desta solução foi aplicada na sonda de amostras do espectrômetro, deixando-a secar. Sobre a amostra seca foi adicionado 0,3 L de solução saturada de acido cinâmico, deixando-a secar novamente, quando foram finalmente realizadas as medidas de massas.
A potência do laser (Nd:Yag – 355nm) foi ajustada para se obter o melhor sinal, tanto para experimentos de MS como MS/MS. Os espectros de massas foram adquiridos à partir dos picos monisotópicos na faixa de m/z de 800 a 3500. Para experimentos de MS/MS, os cinco íons mais intensos de cada espectro MS foram selecionados. O modo reflectron foi utilizado em todas as análises. Depois de terminadas todas as aquisições de cada amostra, os dados foram exportados no formato texto, para serem utilizados ou então, submetidos à análise automática com a ferramenta de bioinformática MASCOT.
3.7. Identificação das Proteínas
O algoritmo inicialmente utilizado para pesquisa dos bancos de dados foi o MASCOT Íon Search versão 2.0 (http://www.matrixscience.com/), utilizando-
Capítulo 2
massa do peptídeo = 0.1 Da e tolerância de massa de MS/MS = 0.3 Da; modificação fixa: carbamidometilação, uma vez que os grupos sulfidril foram tratados com IAA; oxidação da metionina foi considerada como variável de modificação, porque se utilizou um ambiente oxidativo durante a preparação da amostra.
Algumas vezes trechos de seqüências primárias também foram utilizados para identificação das proteínas de interesse, pelo uso de ferramentas de alinhamento de seqüências primárias, frente às informações contidas nos bancos de proteínas, com o uso de ferramentas, para complementar as identificações realizadas pelos protocolos descritos acima. As ferramentas mais comuns nesta situação foram:
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/ http://blast.genome.ad.jp
Capítulo 2
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O fracionamento do veneno bruto por eletroforese bidimensional resultou num gel SDS-PAGE 15% (m/v) com 225 spots, ou seja, 225 prováveis proteínas. As 94 proteínas mais abundantes foram identificadas e caracterizadas no capítulo 1 do presente estudo. A Figura 2 mostra o perfil protéico do veneno bruto da vespa social P. paulista.
FIGURA 2: Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia paulista. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 7 cm de comprimento. Aproximadamente, 225 proteínas foram detectadas pela coloração com CBB.
Réplicas do gel de eletroforese bidimensional do veneno da Polybia paulista foram realizadas e as proteínas eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose, as quais foram bloqueadas com TBS-leite 5% (m/v) por 2 horas e incubadas com os soros de pacientes sensíveis na proporção 1:5, durante a
Capítulo 2
noite (cerca de 18 hs). A seguir, os anticorpos primários e secundários foram acoplados e detectados pelo kit de imunofluorescência.
A Figura 3 representa o resultado da revelação fotográfica do experimento de imunodetecção, onde se utilizou os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da P.paulista. Os números das proteínas assinaladas correspondem àqueles dos spots da Figura 2, a qual representa a composição geral do veneno bruto da vespa em estudo.
FIGURA 3: Imunodetecção com os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa P.paulista, frente ao veneno de vespas da mesma espécie. As 16 proteínas assinaladas são consideradas imunogênicas ao reagirem com IgE-específicas presentes nos soros dos pacientes sensíveis ao veneno de P. paulista.
A Figura 3 revela que 16 proteínas foram imunoreativas ao veneno da vespa social P.paulista, entre elas hialuronidases, fosfolipases A1,
antígenos 5, argininas quinases, proteína transportadora de leucotoxina e proteínas de choque térmico, que estão mostrados na tabela 1, que por sua
Capítulo 2
vez, também mostra as seqüências parciais de cada proteína identificada, nome (funcional), massa molecular (KDa), ponto isoelétrico e código de acesso nos bancos de proteínas/genes.
TABELA 1: Proteínas identificadas como imunogênicas ao veneno de P. paulista contra os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno dessa vespa.
Dentre as 16 proteínas imunoreativas ao veneno da vespa P.paulista desse estudo, quatro são antígenos 5; duas são fosfolipases A1; uma
corresponde à Lipase; quatro são hialuronidases; duas são proteínas de choque Térmico; uma corresponde à proteína transportadora de leucotoxina e duas são argininas quinases. Todas essas proteínas já foram identificadas e caracterizadas molecularmente no capítulo anterior. Porém, faz-se necessário realçar suas principais propriedades.
O Antígeno 5 não apresenta uma função biológica conhecida, porém ele é potencialmente imunogênico, ocorrendo comumente nos venenos de vespas sociais em todo o mundo (HOFFMAN, 1985; KING et al., 1987; SUCK et al., 2000; PIRPIGNANI et al., 2002).
Capítulo 2
As fosfolipases são proteínas alergênicas extensivamente encontradas nos venenos em geral; elas participam na regulação do metabolismo de fosfolipídios em biomembranas, atuam na lise de membranas celulares, promovem a difusão dos antígenos para o interior das células, causando as sérias reações alérgicas e/ou inflamatórias (HOFFMAN et al., 1984).
As hialuronidases induzem IgE específica, agindo no interstício celular, potencializam a infiltração do veneno ao digerir parcialmente a matriz extracelular, facilitando a ação dos demais componentes do veneno, além de causar reações alérgicas em humanos (HOFFMAN, 2006).
A proteína transportadora de leucotoxina é responsável pelo transporte de proteína do tipo-leucotoxina, que de fato é uma toxina responsável por ações citolíticas e/ou hemolíticas. Na prática, a proteína transportadora pode ser considerada uma facilitadora das ações das hemolisinas, que causam lesões no trato respiratório (necroses pulmonares); as proteínas tipo- leucotoxina atuam na ativação de mediadores pró-inflamatórios e estimulam a produção e a liberação de macrófagos e leucócitos (JEYASEELAN et al., 2002).
Como produto de expressão dos genes no reservatório de veneno, as proteínas de choque térmico ou HSPs podem estar associadas à exposição de alguns componentes celulares à degradação bioquímica, à atividade proteolítica e/ou à ação do sistema imune, agravando os quadros de clínicos de alergia dos pacientes sensibilizados por este veneno (WEINSTOCK et al., 2006).
As proteínas argininas quinases identificadas são muito semelhantes ao alérgeno Pem m2 de crustáceos, que é altamente imunoreativo (YU et al., 2003).
Estudos sobre a composição dos venenos de himenópteros mostram que, proteínas como fosfoslipases e antígenos 5 (HOFFMAN, 1993) são imunogênicas, assim como as demais proteínas identificadas no presente estudo. Santos e colaboradores (2004) demonstraram que a imunoterapia com venenos de himenópteros é imunologicamente efetiva em pacientes com reações sistêmico-alérgicas após novas ferroadas de himenópteros. Ensaios
Capítulo 2
de imunodetecção antes e durante o tratamento mostraram que os níveis de IgE específica diminuem, enquanto que os níveis de IgG4 aumentam nos soros dos pacientes sensíveis aos venenos de abelhas e vespas. Além disso, o antígeno 5, a fosfolipase e a hialuronidase foram identificadas como imunoreativos nessa investigação.
Dessa forma, nota-se que as principais proteínas caracterizadas como imunogênicas nesse trabalho são alérgenos já descritos nos venenos de outros himenópteros sociais do hemisfério norte. Provavelmente, a manutenção de estruturas moleculares pela evolução gênica, como os epítopos imunogênicos dos alérgenos, seja crucial para as espécies de vespas que se utilizam do desencadeamento de sintoma alérgicos em suas vítimas como parte de suas estratégias de defesa, uma vez que a inoculação do veneno nessas vítimas está relacionada à proteção do ninho e da prole, e da própria sobrevivência da espécie desta vespa social.
Durante os experimentos de imunodetecção, um dos pacientes sensíveis ao veneno da vespa P.paulista sofreu dois acidentes com essa vespa e seu soro foi coletado após ambos os acidentes. Pode-se observar que, após o segundo acidente desse paciente, houve um aumento no número de proteínas que se mostraram antigênicas (resultados não mostrados). Provavelmente, após o primeiro acidente, o paciente foi sensibilizado com o veneno de P. paulista, e seu sistema imune produziu IgE-específicas contra algumas proteínas do veneno. Porém, o segundo contato desse mesmo paciente com o veneno da P. paulista resultou num quadro de reações alérgicas mais intensas, sendo classificadas como reações de hipersensibilidade imediata de grau II segundo os critérios descritos por Castro (2001), onde o paciente apresentou mal-estar, náuseas, dor abdominal e diarréia.
Uma vez sensibilizado com o veneno da vespa da P. paulista após um primeiro acidente, se fez necessário encaminhar o paciente a um tratamento específico para prevení-lo em acidentes futuros. O agravamento das reações alérgicas num segundo e/ou terceiro acidente é evidente, uma vez que, o sistema imune do paciente já estava sensibilizado anteriormente; o fato de
Capítulo 2
sugere em princípio, que: a) no primeiro acidente algumas proteínas podem não ter sido inoculadas (por estarem ausente do veneno); b) ou tais proteínas estavam presentes em concentrações muito reduzidas para desencadearem respostas imediatas; c) ou ainda, tratam-se de proteínas de baixa imunoreatividade, e necessitaram de duas ou mais inoculações sucessivas, para manifestarem como imunogênicas.
Num segundo momento, os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa social Agelaia pallipes pallipes e com o veneno da abelha Apis mellifera foram incubados com o veneno da vespa social P. paulista individualmente, com o objetivo de se estudar a ocorrência de reações imunológicas cruzadas. A reatividade cruzada entre alérgenos é um evento amplamente descrito na literatura internacional de alergia, sejam eles de mesma origem biológica, ou não (KING et al., 1987). Algumas das proteínas alergênicas reconhecidas por IgE-específica do paciente sensibilizado por A. palipes palipes e por A. mellifera, apresentam reatividade cruzada com componentes proteícos do veneno da P. paulista.
As Figuras 4 e 5, acompanhadas pelas Tabelas 2 e 3, respectivamente mostram os resultados da imunodetecção com os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa social Agelaia palipes palipes e com o veneno da abelha A.mellifera. As Tabelas 2 e 3 mostram as proteínas identificadas com suas respectivas seqüências parciais, nome (funcional), massa molecular (KDa), ponto isoelétrico e código de acesso nos bancos de proteínas/genes.
Capítulo 2
FIGURA 4: Imunodetecção com os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa social Agelaia palipes palipes, frente ao veneno de P.
paulista. As proteínas enumeradas conforme a numeração original mostrada
na figura 2, apresentaram reação imunogênica cruzada ao reagirem com IgE-específicas presentes nos soros dos pacientes sensíveis ao veneno de
A.p.pallipes.
TABELA 2: Proteínas identificadas como imunogênicas no veneno da P.paulista que apresentaram reatividade cruzada com IgE-específicas para o veneno de A .p. pallipes.
Capítulo 2
FIGURA 5: Imunodetecção com o soro de paciente sensibilizado com o veneno da abelha Apis mellifera, frente ao veneno de P. paulista. As proteínas enumeradas conforme a numeração original mostrada na figura 2, apresentaram reação imunogênica cruzada ao reagirem com IgE-específicas presentes no soro do paciente sensível ao veneno de A. mellifera.
TABELA 3: Proteínas identificadas como imunogênicas no veneno da P.paulista que apresentaram reatividade cruzada com IgE-específicas para o veneno de Apis mellifera.
A reatividade cruzada é a habilidade de um antígeno em ligar-se a um determinado anticorpo produzido por outro antígeno. Isso ocorre pelo compartilhamento de um mesmo epítopo, por dois ou mais anticorpos, ou por semelhança de conformações de epítopos (CASTRO, 2001). A importância da reatividade cruzada entre venenos de insetos na prática clínica do alergologista é inquestionável, pois estas interações têm impacto direto sobre o diagnóstico e a melhor conduta terapêutica (CASTRO et al., 1994; CASTRO, 2001). O
Capítulo 2
estudo de semelhanças estruturais entre os componentes dos venenos de diferentes espécies de vespas, bem como a caracterização bioquímica desses venenos é fundamental. Sete proteínas do veneno da vespa social Polybia paulista apresentaram reatividade cruzada com as proteínas do veneno da vespa Agelaia palipes palipes e somente três proteínas do veneno da P. paulista apresentaram reatividade cruzada com o veneno da abelha Apis mellifera. Em comum a todos os ensaios de reações cruzadas, observou-se a proteína do spot 125, correspondente à forma intacta do Antígeno 5, que desta maneira pode ser considerado a alérgeno imunodominante mais importante do veneno de P. paulista.
Estudos sobre a reatividade cruzada entre os venenos de himenópteros mostraram que ela está estreitamente relacionada com a distância filogenética dentre as espécies. Os venenos das vespas dos gêneros Vespula, Doclichovespula e Vespa apresentam níveis de reatividade cruzada elevados. Estudos mostraram que menos da metade dos pacientes alérgicos a venenos de vespas do gênero Polistes apresentam completa reatividade cruzada com os venenos de vespas do gênero Vespula, sendo que com os venenos de abelhas e formigas, a reatividade cruzada foi pouco freqüente ou limitada a venenos de vespas, perante o veneno de outras abelhas e formigas, respectivamente (HOFFMAN, 2004).
Apesar das vespas P.paulista e A.palipes palipes pertencerem a gêneros diferentes, elas são vespas sociais neotropicais. O compartilhamento das principais proteínas alergênicas e/ou epítopos imunogênicos corroboram com a reatividade cruzada observada nesse estudo.
O desenvolvimento de extratos mais específicos é um processo almejado por muitos nas áreas de Imunologia e Alergia, uma vez que, eles conterão os principais alérgenos imunodominantes, sejam eles isolados naturalmente ou sinteticamente.
Durante os últimos quinze anos, o progresso das técnicas de biologia molecular permitiu a clonagem de muitos alérgenos e a investigação da natureza dos mesmos (VALENTA et al., 2004). A disponibilidade de alérgenos
Capítulo 2
em vários aspectos: 1) na análise dos mecanismos da imunoterapia; 2) a utilização de alérgenos recombinantes na imunoterapia; 3) a utilização de alérgenos recombinantes geneticamente modificados para alterar as respostas imunes ou reduzir a atividade alergênica dos mesmos na imunoterapia e 4) o desenvolvimento de testes diagnósticos de alergia (NIEDERBERGER et al., 2004).
O Antígeno 5 das vespas Vespula vulgaris, Dolichovespula maculata e Polistes annularis em suas formas recombinantes foram expressados em Escherichia coli e em leveduras, enquanto que, os recombinantes de fosfolipase A1 e hialuronidase das vespas Vespula vulgaris e Dolichovespula
maculata estão sendo desenvolvidos em sistemas procariotos somente (KING et al., 1996; MULLER, 2002). A tecnologia de alérgenos recombinantes tem apresentado muitas possibilidades para aperfeiçoar o diagnóstico e tratamento de alergia ao veneno dos insetos da ordem Hymenoptera. Coquetéis de alérgenos recombinantes para diagnósticos levaram ao aumento significativo na especificidade dos testes diagnósticos utilizados comumente, como skin prick tests e a estimação de anticorpos específicos no soro dos pacientes sensíveis (MULLER, 2002).
Dessa forma, os resultados obtidos no presente estudo poderão auxiliar no desenvolvimento de extratos mais específicos para o aprimoramento de testes diagnósticos na área de alergia clínica e imunologia, para a imunoterapia de pacientes sensíveis aos venenos dos himenópteros. Coquetéis contendo somente as proteínas potencialmente alergênicas poderiam tornam os processos de desensiblizações mais eficazes, uma vez que a imunoterapia com o veneno bruto desses insetos não são 100% efetivos atualmente (GOLDEN, 2005).
Além disso, o reconhecimento dos alérgenos que apresentam reatividade cruzada entre os venenos de vespas e abelhas se tornou relevante para uma futura investigação individual dos principais alérgenos imunoreativos, uma vez que, há necessidade de maiores informações para a produção de alérgenos recombinantes específicos e em quantidade expressivas. A identificação de alérgenos que apresentam reações cruzadas entre venenos de
Capítulo 2
diferentes espécies de Hymenoptera sociais é importante porque estes antígenos poderão ser utilizados em suas formas purificadas, ou mesmo recombinantes, para enriquecer os extratos utilizados em imunoterapia de pacientes alérgicos a estes insetos, aumentando e eficiência da proteção oferecida pela terapia. Isto também poderá auxiliar na futura manipulação de um extrato de uso mais amplo, para ser utilizado em imunoterapias contra diferentes insetos da ordem Hymenoptera, diminuindo os custos de produção de extratos muito específicos.
Capítulo 2
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANTONICELLI, L.; BILO, M.B. BONIFAZI, F. Epidemiology of Hymenoptera Allergy. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., London v.2, p.341-346, 2002.
BARLOW, D.J.; EDWARDS, J.M.; THORTON, J.M. Continuos and discontinuous protein antigenic determinants. Nature, New York, v.322, p.747- 748, 1986.
CASTRO, F.F.M.; PALMA, M.S.; BROCHETTO-BRAGA, M.R.; MALASPINA, O.; LAZARETI, J.; BALDO, M.A.B.; ANTILA, M.A.; ZUPI, L.; CONSERMELLI,