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3.1. Obtenção do veneno da vespa Polybia paulista

O veneno da espécie Polybia paulista foi fornecido pelo Centro de Estudos de Insetos Sociais / Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP) de Rio Claro-SP. Após a captura, os insetos foram imediatamente congelados a -80ºC e levados ao laboratório para confirmar a identificação taxonômica. As vespas foram então dissecadas e o reservatório do veneno extraído de cada inseto, com o uso de microbisturís. Estes reservatórios foram cuidadosamente lavados, perfurados e agitados suavemente em solução contendo Inibidor de Protease 1 mM (PMSF), e centrifugados a 8000 rpm por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi usado como extrato bruto do veneno. Este extrato foi dialisado durante a noite (18 hs), a fim de retirar o excesso de sal que naturalmente ocorre nesses venenos, uma vez que, as proteínas não são focalizadas corretamente na primeira dimensão da eletroforese, se o extrato apresentar impurezas ou uma elevada quantidade de sal.

3.2. Eletroforese Bidimensional

Para a realização da primeira dimensão foram utilizadas fitas chamadas de Immobilized pH Gradients (gradiente imobilizado de pH) no intervalo de 3 a 10, com 13 cm de comprimento. Estas fitas foram rehidratadas durante a noite, à temperatura ambiente, em 250 L de uma solução de rehidratação, contendo uréia 8M, CHAPS 2% (v/v), solução tampão IPG a 1% ( v/v), DDT 19 mM e azul de bromofenol, juntamente com 700µg do extrato de veneno bruto dialisado. As proteínas foram separadas conforme seus diferentes pontos isoelétricos utilizando três passos: 1º) 200 V por 30 minutos, 2º) 1000 V por 30 minutos e 3º) 8000V por 3:30 hs. Em seguida, as fitas foram equilibradas por 20 minutos em presença de solução contendo: DTT 19 mM, Tris 50 mM, uréia 6 M, glicerol 30% (v/v), SDS 2% (m/v) e depois por mais 20 minutos, na mesma solução, exceto pela substituição do DTT por Iodoacetamida (IAA) 0,2M.

Para a realização da segunda dimensão, a fita de gradiente de pH oriunda da primeira dimensão, foi colocada no topo de um gel de poliacrilamida

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a 15% (m/v). A eletroforese foi realizada em temperatura ambiente, utilizando- se dois passos: 15 mA por gel por 15 minutos e depois, 30 mA por gel por 2-4 horas. Após a separação na segunda dimensão, as proteínas foram visualizadas por coloração com prata e/ou por Coomassie Brilliant Blue (CBB).

3.3. Eletrotransferência

A técnica de eletrotransferência ou Western blotting consiste na transferência eletroforética de proteínas separadas pela eletroforese, para uma matriz suporte de PVDF (Fluoreto de Polivinilideno) ou nitrocelulose em solução tampão de transferência composta por: Tris 20 mM, Glicina 192 mM, SDS 0,1% (m/v) em pH 8,3 em metanol a 10% (v/v).

Os géis de SDS-PAGE que não foram corados com CBB foram eletrotransferidos do gel para membranas de PVDF com o auxílio da cuba de eletrotransferência Semi-Dry TE 70 (Amersham Biosciences – GE). Previamente determinaram-se e anotaram-se as medidas do gel quanto à comprimento e altura. Nestes experimentos, os géis apresentaram 14 x 14 cm. As membranas de PVDF foram cortadas exatamente do mesmo tamanho dos géis.

Num reservatório contendo tampão de transferência montou-se um “sanduíche” na seguinte ordem: três folhas de papel de filtro comum e uma membrana de PVDF, gel, três folhas de papel de filtro comum, sendo que este conjunto permaneceu por 10 minutos em repouso, para o equilíbrio de todo sistema no tampão de transferência. É necessário ressaltar que, a membrana de PVDF foi hidratada por 15 segundos em metanol, antes de inserí-la no tampão de transferência. Estes procedimentos foram realizados com luvas para evitar contaminação da membrana.

O conjunto foi colocado rapidamente na cuba de transferência na seguinte ordem: a partir do cátodo da cuba, primeiramente três folhas de papel filtro, o gel, a membrana e mais três folhas de papel filtro. Os parâmetros utilizados foram: 250 V, 200 mA por 1 e 30 minutos para géis de 14 x 14 cm. Após a eletrotransferência a membrana foi corada com Ponceau a fim de

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testemunhar a eficiência da transferência. A membrana foi então descorada com água para remover o Ponceau.

Em seguida, a membrana eletrotransferida foi submetida à coloração com CBB a fim de permitir a visualização dos spots de proteínas, que foram então recortados e submetidos ao sequenciamento por Química Degradativa de Edman. A membrana foi lavada com água destilada por 3 vezes de 5 a 10 minutos, em seguida, corada com CBB R-250 0,025% (m/v) em metanol 40% (v/v) por 5 minutos e descorada com metanol 50% (v/v) por 20 minutos. A membrana foi lavada com água destilada por 15 minutos e seca em temperatura ambiente por 12 horas antes de submetê-la ao sequenciamento.

3.4. Espectrometria de Massas

Os experimentos de espectrometria de massas foram realizados num espectrômetro do tipo MALDI/ToF adquirido pela FAPESP, marca ETTAN (Amersham Biosciences - GE) instalado no Instituto do Coração (InCor), S.P. e em espectrômetros do tipo MALDI-TOF/TOF, marca Applied Biosciences, modelo 4000, adquiridos pela FAPERJ e instalados do Laboratório de Toxinologia Aplicada na Fundação Oswaldo Cruz (FioCruz) no Rio de Janeiro, R.J., e na Proteomics and Mass Spectrometry Facility na Cornell University – Ithaca – NY (EUA).

Inicialmente foi realizado um protocolo tentativo de identificação das proteínas por impressão digital peptídica (PMF) baseado na digestão das proteínas in-gel com tripsina, seguido da medida das massas dos peptídeos trípticos resultantes. Em seguida, foram escolhidos os picos mais intensos do espectro gerado na impressão digital de cada proteína analisada, para se obter as seqüências desses fragmentos trípticos.

As manchas de proteínas de interesse, coradas com CBB, foram recortadas do gel, descoloridas com solução de bicarbonato de amônio 25 mM pH 8,0 e acetonitrila 50% (v/v), desidratados com acetonitrila 100%, sendo então os pedaços de gel secos por centrifugação à vácuo. Em seguida, os pedaços de géis secos foram digeridos com tripsina, seguindo-se o protocolo: dissolveu-se 20 g de tripsina não autolítica em 900 µL de tampão bicarbonato

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de amônio 50 mM, pH 8,0 e 100 µL de ácido acético glacial. Cada pedaço de gel seco foi incubado com 20 L da solução de tripsina (0,4 g de tripsina), durante 18 horas a 37oC; a digestão foi interrompida adicionando-se 150 L de solução de acetonitrila 50% (v/v) em água destilada [contendo ácido trifluoracético a 5% (v/v)] e mantendo-se a suspensão de gel em repouso à temperatura ambiente por 30 min; em seguida, a suspensão contendo o gel foi centrifugada a 8.000 rpm por 10 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e seco por centrifugação a vácuo, sendo então mantido a –20ºC até ser analisado por espectrometria de massas.

Para a análise da amostra no espectrômetro de massas, as amostras foram reconstituídas adicionando-se 5 L de solução de acetonitrila 50% (v/v) [contendo TFA 0,5% (v/v)] e solubilizando-se os peptídeos gerados durante a digestão tríptica; 0,3 L desta solução foi aplicada na sonda de amostras do espectrômetro, deixando-a secar. Sobre a amostra seca foi adicionado 0,3 L de solução saturada de acido cinâmico, deixando-a secar novamente, quando foram finalmente realizadas as medidas de massas.

A potência do laser (Nd:Yag – 355nm) foi ajustada para se obter o melhor sinal, tanto para experimentos de MS como MS/MS. Os espectros de massas foram adquiridos a partir dos picos monoisotópicos na faixa de m/z de 800 a 3500. Para experimentos de MS/MS, os cinco íons mais intensos de cada espectro MS foram selecionados. O modo reflectron foi utilizado em todas as análises. Depois de terminadas todas as aquisições de cada amostra, os dados foram exportados no formato texto, para serem utilizados ou então, submetidos à análise automática com a ferramenta de bioinformática MASCOT.

3.5. Identificação das Proteínas

O algoritmo inicialmente utilizado para pesquisa dos bancos de dados foi

o MASCOT Íon Search versão 2.0 (http://www.matrixscience.com/), utilizando- se os seguintes parâmetros: clivagens faltantes = 1; tolerância de massa do peptídeo = 0.1 Da e tolerância de massa de MS/MS = 0.3 Da; modificação fixa: carbamidometilação, uma vez que os grupos sulfidril foram tratados com IAA;

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oxidação da metionina foi considerada como variável de modificação, porque se utilizou um ambiente oxidativo durante a preparação da amostra.

Algumas vezes trechos de seqüências primárias também foram utilizados para identificação das proteínas de interesse, pelo uso de ferramentas de alinhamento de seqüências primárias, frente às informações contidas nos bancos de proteínas, com o uso de ferramentas, para complementar as identificações realizadas pelos protocolos descritos acima. As ferramentas mais comuns nesta situação foram:

http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/ http://blast.genome.ad.jp

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