Biyokimyasal Yöntemler

4.2.1.1. Enzim Ġmmun Ölçüm Yöntemleri

Enzim Ġmmun Ölçüm Yöntemleri (EIA), spesifik antijen-antikor bağlanma reaksiyonlarından faydalanarak aranan antijeni ya da antikoru tayin etmek ya da ölçmek için kullanılan immünokimyasal yöntemlerdir. EIA yöntemlerinin esasında enzimlerin katalitik özelliklerinin kullanılması yatmaktadır. Bu yöntemde belirteç olarak glukoz 6-fosfat dehidrogenaz ve β-galaktozidaz gibi çeĢitli enzimlerden yararlanılsa da alkalen fosfataz ve horseradish peroksidaz en sık kullanılan enzimlerdir. EIA tekniği, enzim bağlı immunosorbent ölçüm

134

(ELISA) ve Enzim-multipl immün ölçüm tekniği (EMIT) gibi farklı isimlerle de anılmaktadır.

ELISA; serum, plazma, idrar, tükrük, periton sıvısı ve perikard gibi çeĢitli vücut sıvılarından ve doku homojenizatlarından elde edilen süpernantantlarda araĢtırılan antijen (Ag)/ antikor (Ab) düzeylerinin ölçümünde, kendilerine spesifik Ab/Ag‟ ler ve çeĢitli enzimler yardımı ile gözlenen renk değiĢimlerinin plate okuyucularda otomatize olarak hesaplanmasına dayalı EIA tekniğidir. Klinik analizlerde kabul gören duyarlı bir tekniktir (93, 402). ELISA çalıĢması için gerekli olan araç ve gereçlerin listesi Tablo 7‟de gösterilmiĢtir.

Tablo 7. ELISA Yöntemi için Gerekli Sarflar ve Gereçler

ELISA yöntemi için gerekli olan malzemelerin listesi ELISA kiti

Standartları hazırlamak için steril eppendorf tüpler

10-100-1000 µL hacim kapasiteli otomatik pipetler ve pipet uçları 0-100 µL hacim kapasiteli ve 8 kanallı otomatik pipet ve pipet uçları Ġnkübatör (shaker)

Vortex

ELISA yıkayıcısı, okuyucusu ve yazıcısı

100 mL ve 500ML‟lik hacimli beher, erlanmayer Benmari

Distile su Kurutma kağıdı Buzdolabı

4.2.1.1.1. Plazma CA 15-3 Düzeylerinin Belirlenmesi

Sıçan plazma CA 15-3 düzeyleri, YLbiont marka, sıçan için uyumlu ELISA kiti kullanılarak çalıĢıldı. Kitin Katolog numarası: YLA0753RA , Lot numarası: 20161111045, intra-assay: CV< %8, inter-assay: CV< %10, ölçüm

135

aralığı: 0,3-90 µIU/mL ve sensitivitesi: 0,15 µIU/mL idi. Kit içeriğindeki standartlar 450 nm de ELX800 ELISA okuyucusunda (BioTek Instruments, USA) spektrofotometrik olarak okutularak elde edilen otomotik absorbans standart grafiği değerleri (ġekil 25) kullanılarak numune sonuçları ölçüldü. Plate yıkamalarında ise otomatik yıkayıcı olarak Bio-tek ELX50 (BioTek Instruments, USA) cihazı kullanıldı. Kit içeriğinde bulunan malzemelerin listesi Tablo 8‟de verilmiĢtir.

Tablo 8. CA 15-3 ELISA Kitinin içeriği

Malzemeler Miktarları

Stok Standart solüsyonu (96µIU/mL) 0,5 mL

Standart Dilüenti 3 mL

Antikor kaplı ELISA plate 12 Kuyucuk × 8 (96‟lık)

Streptovidin-Horse Radish Peroksidaz (HRP) konjugatı 6 mL

Yıkma solüsyonu 30X 20 mL

Biotinli Anti CA15-3 Monoclonal Ab 1 mL

Kromojen solüsyonu A 6 mL

Kromojen solüsyonu B 6 mL

Stop Solüsyonu 6 mL

Tüketici talimat klavuzu 1 adet

Plate üzerini kapatmak için membran 2 adet

136

ġekil 25. Plazma CA 15-3‟ün Düzey Tayininde Kullanılan ELISA Standart Grafiği

4.2.1.1.2. Plazma CEA Düzeylerinin Belirlenmesi

Plazma CEA düzeyleri, sıçan CEA - ELISA kiti (Ylbiont, Shangai YL Biotech Co Ltd, Katalog no: YLA1432RA, Lot no: 20170801010, Shangai, China) kullanılarak kit prosedürüne uygun olarak çalıĢıldı. Absorbanslar ELX800 ELISA okuyucusunda spektrofotometrik olarak 450 nm‟de okutuldu. Plate yıkamalarında ise otomatik yıkayıcı olarak Bio-tek ELX50 (BioTek Instruments, USA) cihazı kullanıldı. Sonuçlar ng/mL olarak kayıt altına alındı. Kitin intra-assay değeri: CV< %8, inter-assay değeri: CV< %10, ölçüm aralığı: 0,05-30 ng/mL ve sensitivitesi: 0,031ng/mL idi.

4.2.1.1.3. Plazma VEGF Düzeylerinin Belirlenmesi

Plazma VEGF düzeyleri, sıçan VEGF - ELISA kiti (Ylbiont, Shangai YL Biotech Co Ltd, Katalog no: YLA0190RA, Lot no: 20170715070, Shangai, China) kullanılarak kit prosedürüne uygun olarak çalıĢıldı. Optik

y = (A-D) / (1+ (x/C)^B) +D A=0.069 B=1.318 C=21.266 D=1.995 R² = 0.9968 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 10 20 30 40 50 60 Abso rb an s Konsantrasyon (µIU/mL)

137

dansiteler ELX800 ELISA okuyucusunda spektrofotometrik olarak 450 nm‟de okutuldu. Plate yıkamalarında ise otomatik yıkayıcı olarak Bio-tek ELX50 (BioTek Instruments, USA) cihazından yararlanıldı. Sonuçlar ng/mL olarak verildi. Kitin intra-assay değeri: CV< %8, inter-assay değeri: CV< %10, ölçüm aralığı: 10-3000 ng/mL ve sensitivitesi: 5,01 ng/mL idi.

4.2.1.1.4. Plazma MMP-9 Düzeylerinin Belirlenmesi

Plazma MMP-9 düzeyleri, sıçan MMP-9 - ELISA kiti (Ylbiont, Shangai YL Biotech Co Ltd, Katalog no: YLA0585RA, Lot no: 20170625036, Shangai, China) kullanılarak kit prosedüründe tarif edildiği gibi çalıĢıldı. Absorbanslar ELX800 ELISA okuyucusunda spektrofotometrik olarak 450 nm dalga boyunda okutuldu. Plate yıkamalarında ise otomatik yıkayıcı olarak Bio-tek ELX50 (BioTek Instruments, USA) cihazı kullanıldı. Sonuçlar ng/mL olarak belirtildi. Kitin intra-assay değeri: CV< %8, inter-assay değeri: CV< %10, ölçüm aralığı: 0,05-10 ng/mL ve sensitivitesi: 0,01 ng/mL idi.

4.2.1.1.5. Plazma NF-κB Düzeylerinin Belirlenmesi

Plazma NF-κB düzeyleri, sıçan NF-κB - ELISA kiti (Ylbiont, Shangai YL Biotech Co Ltd, Katalog no: YLA0113RA, Lot no: 20170715071, Shangai, China) kullanılarak kit prosedüründe belirtildiği üzere çalıĢıldı. Absorbanslar ELX800 ELISA okuyucusunda spektrofotometrik olarak 450 nm‟de okutuldu. Plate yıkamalarında ise otomatik yıkayıcı olarak Bio-tek ELX50 (BioTek Instruments, USA) cihazı kullanıldı. Sonuçlar ng/mL olarak verildi. Kitin intra-assay değeri: CV< %8, inter-assay değeri: CV< %10, ölçüm aralığı: 0,05-20 ng/mL ve sensitivitesi: 0,023 ng/mL idi.

138

4.2.1.2. Doku Numunelerinin Homojenizasyonu

Derin dondurucuda -80 0C‟de saklanan meme dokuları oda ısısına geldikten sonra 100 mg olacak Ģekilde Ģeklinde hassas terazide (SARTORĠUS GMBH, Germany) tartıldı. Daha sonra bu dokular üzerine 900mL 0,15M KCI (1;9,w;v) çözeltisi ilave edilerek +40_{C‟de, homojenizatör (Ultra TurraxType T25-B, IKA}

Labortechnic, Germany) yardımı ile 16000 rpm‟de 3 dk homojenize edildi. Elde edilen Homojenatlar 5000xg‟de 1 saat (+4ºC‟de) santrifüjlenerek berrak bir süpernantant elde edilene kadar iĢlem tekrar edildi ve elde edilen berrak süpernatantlar, oksidan ve anti-oksidan parametrelerin ölçümlerini gerçekleĢtirmek için ayrı ayrı numaralandırılmıĢ eppendorf tüplere aktarıldı ve uygun saklama koĢullarında muhafaza edildi.

4.2.1.3 Lowry Yöntemine Göre Protein Düzeylerinin Tayini

Süpernatantlardaki protein düzeyleri Lowry metoduna göre (403), tayin edildi. Bu yöntemin pensibi; alkali ortamda proteinlerin Folin-Fenol ayıracı ile mavi bir renk oluĢturmasına dayanmaktadır.

Ayıraçlar: