Biyofilm Oluşum Çalışmaları

Bakteriler hayatta kalabilmek için önemli olan genlerin ekspresyonunu değiştirerek sıcaklık, pH, ozmoz ve besin kullanılabilirliği gibi değişen çevresel koşullara adapte olabilirler. Bakteriler tek bir hücre yerine topluluklar oluşturarak bu olumsuzlukların üstesinden gelmektedir. Bu nedenle çoğu bakteri, hem biyotik hem de abiyotik strese karşı çevreyi algılama sistemi olarak adlandırılan bir işlemle gen ekspresyonunu değiştirerek olumsuz koşullara yanıt vermektedir (Whitehead ve ark., 2001; Sibanda ve ark., 2018)

Bitki patojeni bakterilerin lokal populasyon yoğunluklarını belirlemek için Quorum Sensing olarak adlandırılan küçük sinyal moleküllerine sahiptirler. Bitki patojeni bakterilerden, Ralstonia solanacearum'daki hareketlilik, Erwinia carotovora'daki antibiyozis ve Xanthomonas campestris'deki UV ışınlarına dayanıklılık gibi genleri düzenlemek için QS sinyallerini kullanılır. QS sinyalleri ayrıca, bitki patojeni bakteriler tarafından, Pseudomonas stewartii, X. campestris ve R. solanacearum'daki psopolisakaritler dahil olmak üzere ana patojenisite faktörlerini başlatmak için kullanılmaktadır (von Bodman ve ark., 2003; Baştaş ve Kannan, 2015).

Bir yüzeye bağlı bakteri popülasyonlarına biyofilm denir ve önemli bir virülans faktörü olarak da işlev görebilir. Patojenik bakteri türleri tarafından enfeksiyonun başlamasından önce, bakteriler tarafından stabil biyofilm-popülasyon büyüklüğü oluşturulmalıdır.

Bakteriler çevreleriyle ve birbirleriyle sözcükler yerine kimyasal sinyal molekülleri kullanarak etkileşim yeteneğine sahip sosyal organizmalardır (Miller ve Bassler, 2001; Waters ve Bassler, 2005; Rasmussen ve Givskov, 2006). Bakteriler sinyal moleküllerini içinde bulundukları ortama salgılayabildikleri gibi bu moleküllerin ortamdaki yoğunluğunu ölçebilen ve QS adı verilen bir mekanizmaya sahiptirler (Parsek ve Greenberg, 2005; Diggle ve ark., 2007; Ng ve ark., 2011; Baştaş ve Kannan, 2015). Bakteriler ortamdaki sinyal moleküllerinin yoğunluğunu ölçerek aslında çevrelerindeki hücre yoğunluğu hakkında bilgi edinmiş olurlar. Yani ortamdaki sinyal molekülü yoğunluğu onu salgılayan hücrelerin miktarıyla doğru orantılıdır (Bassler ve Losick, 2006).

QS sisteminde kullanılan sinyal molekülleri türden türe değişmekle birlikte üç ana gruba ayrılmıştır. Bunlar Açil-Homoserin Lakton (AHL veya HSL) türevleri, küçük peptitler, Furanosil Borat Diester’ dir. AHL sinyal molekülleri gram negatif bakteriler tarafından kullanılır. Küçük peptit sinyal molekülleri ise gram pozitif bakteriler tarafından kullanılır. Furanosil borat diester ise bazı gram negatif veya gram pozitif bakteriler tarafından kullanılmaktadır (Deep ve ark., 2011, March ve Bentley 2004 ).

Mew (1984) tarafından yapılan çalışmada çeltik bakteriyel yanıklığına neden olan Xanthomonas campestris pv. oryzae’ya hassas ve dayanıklı olan iki çeltik (Oryza sativa) çeşidine (TN1 ve CAS 209) Xanthomonas campestris pv. oryzae’nın üç farklı izolatının (PX061 her iki çeşit için virülant, PX086 izolatı TN1 çeşidi için virülant, PX0101 izolatı ise her iki çeşit için virülant değil) inokulasyonu sonrası 1, 24, 48 ve 72 saat sonra alınan yaprak örnekleri taramalı elektron mikroskopta incelenmiştir. Sonuç olarak tüm kombinasyonlarda inokulasyondan 1 saat sonra yaprak yüzeyinde bakteri hücre sayısında belirgin bir fark görülmediğini, inokulasyondan 24 saat sonra, TN1 ve CAS 209 çeşidi için PX061 izolatının su gözenekleri dışında çoğaldığını ve bu gözeneklerden giriş yaptığını, PX0101 bakteri hücrelerinin, yaprak yüzeyinde belirgin bir şekilde çoğalmadığını ve su gözenekleri tarafından salgılanan ince bir eksudat tabakasına gömüldüğünü, TN1’e virülent ancak CAS 209’a avirulent olan bakteri hücrelerinin TNl’in su gözeneklerinde çoğaldığını, ancak aşılamadan 48 saat sonra CAS 209 çeşidinin eksudatlar içinde tutulduğunu ve her üç izolatında her iki çeşidin stomalarında çoğalmadığını bildirmişlerdir.

Morris ve ark. (1997) yapmış oldukları çalışmada ıspanak, marul, çin lahanası, kereviz, pırasa, fesleğen, maydanoz ve geniş yapraklı hindiba bitkilerinin yaprak yüzeylerinde bulunan mikroorganizmaların biyofilm oluşumunu epifloresan

mikroskobu, taramalı elektron mikroskobu ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak incelemişlerdir. Sonuç olarak incelenen tüm bitkilerin yaprak yüzeylerinde her üç yöntemle de biyofilm oluşumunun gözlemlenebildiğini bildirmişlerdir.

Jacques ve ark. (2005) yapmış oldukları çalışmada adi yaprak yanıklığı hastalığına neden olan X. a. pv. phaseoli bakteriyel patojenine oldukça hassas iki fasulye çeşidinde (Michelet ve Contender) hastalıklı yaprak yüzeylerinin simptomatik bölgelerinden alınan yaprak örneklerinde biyofilm oluşumunu taramalı elektron mikroskobunda ve bitkilere uygulanan hidrik stresin biyofilm üzerindeki etkisini incelemişlerdir. Sonuç olarak X. a. pv. phaseoli biyofilm populasyonlarının Michelet fasulye çeşidinin ekiminden sonraki 41, 56 ve 69. günlerde ve Contender fasulye çeşidinin ekiminden sonraki 27, 33, 48, 61 ve 82. günlerde önemli bir farklılık olmadığını, stres uygulanması sonucunda, yaprak yüzeyindeki populasyonların azaldığını, biyofilm fraksiyonunun sabit kaldığını bildirmişlerdir.

Gürel ve Şerbetçi (2009) tarafından yapılan çalışmada zeytin ağaçlarında dal kanseri hastalığına neden olan P. syringae pv. savastanoi izolatlarında quorum- sensing’den sorumlu Açil-homoserin lakton (AHL) molekülü incelenmiştir. Sonuç olarak bakterinin sentezlediği bu molekülün bir N-(3-okzo-hekzanoil)-L-homoserin lakton (OHHL) olduğunu saptanmıştır.

Carvalho ve ark. (2011) tarafından yapılan çalışmada fasulye ve börülce bitkilerine X. a. pv. phaseoli inokulasyonu sonrası 6, 12, 24 ve 48 saat sonra alınan yaprak örnekleri ve X. a. pv. phaseoli ile fasulye ve börülce arasındaki etkileşimler taramalı elektron mikroskopta incelenmiştir. Sonuç olarak taramalı elektron mikroskobu görüntüleri, her iki türün yaprak yüzeylerinde 6-48 saat boyunca morfolojik değişiklikler olduğunu börülce bitkisi yaprağında 48. saatte, X. a. pv. phaseoli'nin stomaya yakın dağılımını, stomada, koruyucu ve yardımcı hücrelerin 12 ila 48 s arasındaki hafif farklarla küçüldüğünü, fasulye bitkilerinin stomalarının da börülce bitkisindeki morfolojik değişimlerle benzerlik gösterdiğini bildirmişlerdir.

Çepni (2014), yaptığı çalışmada Rize ve İstanbul’da yetişen 26 bitki türünün anti-QS aktivitelerini Chromobacterium violaceum 12472, C. violaceum 026, Micrococcus luteus RSKK 1123, Lactococcus lactis ATTC 11454 bakterileri üzerinde bitki ekstreleri bakteri kültürüne eklenerek bir aminoasit olan nisin üretiminin baskılanmasını indikatör bir ırk aracılığıyla test edilmiş ve sonuçlar ters-transkriptaz (RT)-PCR analizi ile desteklenmiştir. Sonuç olarak, 22 bitkide anti-QS aktivite gözlemlenmemiştir. Quercus robur L., Quercus frainetto Ten., Epilobium angustifolium

L. ve Tanacetum balsamita L. subsp. balsamitoides’in ekstrelerinde %31-62 arasında anti-QS aktivite bulunmuştur. Yüksek aktivite gösteren Quercus robur L.’nin etil asetat fraksiyonunda, viyolasin üretimi % 92 oranında baskılanmıştır.

Mori ve ark., (2018) tarafından yapılan çalışmada domates bitkisine Ralstonia solanacearum inokulasyonu sonrası domates yapraklarının alt epidermis katmanlarında patojen virülansı için gerekli olan biyofilmleri görüntülemek amacıyla inokulasyondan 18 ve 24 saat sonra aldıkları yaprak örneklerini taramalı elektron mikroskopta incelemişlerdir. Sonuç olarak inokulasyondan 18 saat sonra hücreler arası alanlar ve domates hücrelerinin yüzeylerinde mikro koloniler, 24 saat sonra hücre dışı bir matris ile çevrili biyofilm benzeri yapılar görüntülediklerini bildirmişlerdir.