Askorbat Peroksidaz (APX, EC 1.11.1.11) Enzim Analizi Sonuçları

P. s. pv. phaseolicola ve X. a. pv. phaseoli’ye ait 2’şer izolat (522-p, 510-p, 120- x, 145-x) ile enfekte edilmiş 4 haftalık 36-K ve Aras-98 fasulye çeşitleri üzerinde zamana bağlı olarak meydana gelen Askorbat Peroksidaz (APX) Enzim aktivitesindeki değişimler gözlemlenmiştir. Üç tekerrürlü olarak yapılan analiz sonuçlarına göre elde edilen veriler karşılaştırıldığında Çeşit x Bakteri x Zaman bakımından istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0,01).

Aras-98 çeşidi için kontrol bitkilerin yapraklarında APX enzim aktivitesi 0, 12, 24, 36 ve 72. saatlerde sırasıyla 2,36 ± 0,24, 1,84 ± 0,15, 1,94 ± 0,06, 1,84 ± 0,22, 2,18 ± 0,31 Ügr-1_{/YA enzim olarak saptanmıştır. Aras-98 çeşidinde P. s. pv. phaseolicola ve}

X. a. pv. phaseoli inokulasyonu sonrası Aras-98 çeşidinde P. s. pv. phaseolicola’ye ait 522-p izolatı hariç tüm uygulamalarda kontrol bitkilerine kıyasla bir artış görülmemiştir. 522-p izolatı inokulasyonu sonrası 36. saate meydana gelen artış ise beklenen düzeyde değildir.

Aras-98 çeşidinde P. s. pv. phaseolicola inokulasyonu sonrası meydana gelen APX enzim aktivitesi tüm zamanlarda X. a. pv. phaseoli inokulasyonu sonrasında olduğu gibi artış ve azalış göstermiş fakat kontrol bitkilerinin enzim aktivitesinden daha düşük olduğu belirlenmiştir. Burada dikkati çeken yalnızca 522-p izolatı inokulasyonu sonrası 24. saatte kontrol bitkilerine kıyasla bir miktar artış belirlenmiştir (Çizelge 4.4 ve Şekil 4.6).

36-K genotipi için kontrol bitkilerin yapraklarında APX enzim aktivitesi 0, 12, 24, 36 ve 72. saatlerde sırasıyla 3,07 ± 1,10, 2,69 ± 1,19, 1,37 ± 0,20, 2,75 ± 1,13, 2,80 ± 1,40 Ügr-1_{/YA enzim olarak saptanmıştır. P. s. pv. phaseolicola inokulasyonu için}

510-p izolatı inokulasyonu sonrası en yüksek enzim artışı 24. saatte gözlemlenmiş olup, 522-p izolatı inokulasyonu sonrası ise 36. saatte 7.93 ± 0.84 Ügr-1/YA’lık bir enzim artışı ile tüm parametrelere kıyasla en yüksek enzim aktivitesi olarak kaydedilmiştir. 36- K genotipi X. a. pv. phaseoli için 120-x ve 145-x izolatı inokulasyonu sonrası tüm zamanlarda bir değişiklik gözlemlenmemiştir (Çizelge 4.4 ve Şekil 4.6).

Bitkilerde hücre için zararlı olan biyotik ve ya abiyotik stres koşullarında ortaya çıkan ROS'u detoksifiye edebilen antioksidan savunma sistemleri mevcuttur. Bitki hücrelerindeki bu antioksidan savunma sistemlerinden biri de APX’in majör bir hidrojen peroksitin detoksifikasyon sisteminde yer alarak, spesifik bir elektron donör olan askorbatı kullanılmasıyla H2O2'nin H2O'ya dönüşümünü katalizleyen askorbat

glütasyon döngüsüdür (Caverzan ve ark., 2012). Askorbat-glutation döngüsünde APX kilit bir enzimdir ve H2O2'yi suya indirgemek için spesifik elektron vericisi olarak

askorbik asiti kullanır ve H2O2'nin monodihidroascorbat (MDHA) ve 2H2O'ya

dönüşümünü katalize eder. APX stres sonrası kloroplastlar, sitosol, mitokondri ve peroksizomlarda ROS metabolizmasına katılarak artan H2O2'nin toksik etkilerini yok

eder (Asada, 1992b; Payton ve ark. 2001; Blokhina ve ark. 2003).

Çalışmamızdan elde edilen sonuçlar incelendiğinde en yüksek APX enzim aktivitesi dayanıklı çeşit olan 36-K fasulye genotipinde P. s. pv. phaseolicola 522-p izolatı inokulasyonu sonucu saptanmıştır. Aynı çeşit için X. a. pv. phaseoli inokulasyonu sonrası APX enzim aktivitesi yeterli düzeyde artış göstermemiş olup, kontrol gruplarına göre daha düşük bir aktivite sergilemiştir. Dayanıklı bir genotip olan 36-K’da X. a. pv. phaseoli inokulasyonu sonrası APX aktivitesinde görülen azalmanın patojen kaynaklı bir toksinin direk olarak APX enzim aktivitesini inhibe etmesi nedeniyle olabileceği gibi glikoz 6 fosfat dehidrogenaz enzimini inhibe ederek NADPH miktarının azalmasıyla glutatyonun tekrar indigenememesinden olabileceği düşünülmektedir (Roush ve Gowdy, 1961). Bir başka düşüncemiz ise 36-K genotipi için X. a. pv. phaseoli’ye dayanıklılıkta APX’den sorumlu genlerin transkripsiyonunun gerçekleşmemiş olabileceği ya da POX, CAT gibi enzimlerin APX ile kombine çalışması ve ortak substratlarının H2O2 olmasından dolayı ortamdaki substratın

azalmasıyla APX’in bu genotipin savunma sisteminde yetesiz kalmasıdır. Dolayısıyla enzim aktivitesi bitkiden bitkiye değişiklik gösterebileceği gibi inokule edilen patojen ve patojene ait izolatlara göre de değişiklik göstermektedir.

Elde edilen verilere göre 36-K genotipinde APX’in patojen savunmasına karşı dayanıklılıkta rol aldığını, Aras-98 çeşidinde ise savunma mekanizmasında ise yer almadığını söyleyebiliriz.

Türkan ve ark., (2005) abiyotik strese hassas ve tolerant fasulye (P. vulgaris L. FM 53 ve P. acutifolius L.) bitkilerinde stres sonrası APX enzim aktivitelerini incelemişler dayanıklı çeşidin kontrol bitkileri ve hassas çeşide göre daha yüksek APX enzim aktivitesi gösterdiğini bildirmişlerdir.

Leite ve ark. (2014) Sclerotinia sclerotiorum patojen inokulasyonu sonrası fasulyede 12, 24, 48, 72, 96 ve 120 saatlerde alnınan yaprak örneklerinde tüm fasulye çeşitlerinde APX enzim aktivitesinde artış ve azalışların olduğunu bildirmişlerdir

Akoğlu (2013) bazı taze fasulye (Phaseolus vulgaris L.) genotiplerinde stres sonrası APX aktivitesinde artış görüldüğünü, Doğan (2013) stres sonrası soya

fasulyesinde APX’de azalma olduğunu, Demirtaş (2011) fasulyede stres sonrası APX’de önce artış sonra azalma olduğunu, Zlatev ve ark. (2006) fasulyede stres sonrası tüm çeşitlerde APX aktivitesinin arttığını, Yılmaz (2015) fasulyede stres sonrası APX’de değişiklik olmadığını, Keshavarz-Tohid ve ark. (2016) fasulyede patojen inokulasyonu sonrası 6, 12, 24. saatlerde APX aktivitesinin arttığını bildirmişlerdir. Bizim bulgularımız sonucunda 36-K genotipinde oksijen radikallerinde meydana gelen artışa bağlı olarak savunma sisteminde APX yer almakla birlikte Türkan ve ark., (2005), Demirtaş (2011) Akoğlu (2013), ve Leite ark. (2014), Keshavarz-Tohid ve ark. (2016) tarafından yapılan çalışmaları destekler yönde edilmiştir.

Aras-98 fasulye çeşidi ve 36-K fasulye genotipi fidelerinin kontrol, P. s. pv. phaseolicola ve X. a. pv. phaseoli ile inokule edilmiş fasulye fideleri yapraklarında yapılan analizler sonucunda belirlenen Askorbat Peroksidaz (APX) enzim aktivitesi ölçüm sonuçları Çizelge 4.4 ve Şekil 4.6’da verilmektedir.

Çizelge 4.4. APX aktivitesi bakımından P. s. pv. phaseolicola ve X. a. pv. phaseoli inokule edilmiş fasulye çeşit/genotip ve uygulama zamanları arasındaki değerlendirme

ÇEŞİT PATOJEN ZAMAN (Saat)

0. 12. 24. 36. 72. ARAS-98 Psp1 0.1520±0.0803 B b 0.2070±0.0260 B a 1.5537±0.3869 AB ab 2.0393±0.6077 A a 1.6590±0.3054 A ab Psp2 0.3893±0.0217 A b 1.3277±0.4805 A a 1.3853±0.0759 A ab 0.2973±0.0497 A b 0.4720±0.0899 A b Xap1 0.6360±0.2676 A b 0.6183±0.1116 A a 0.2543±0.0525 A ab 0.2667±0.0698 A b 1.2453±0.3197 A ab Xap2 0.4927±0.0517 A b 1.7320±0.4372 A a 0.2577±0.0745 A b 0.2533±0.0323 A b 0.7340±0.0000 A ab KONTROL 2.3610±0.2380 A a 1.8433±0.1477 A a 1.9443±0.0614 A a 1.8390±0.2195 A ab 2.1747±0.3065 A b 36-K Psp1 1.6107±0.5056 D ab 2.8307±1.2825 CD a 4.5450±0.4414 B a 7.9323±0.8347 A a 3.7690±0.4428 BC a Psp2 1.6007±0.5069 B ab 0.3297±0.0683 B b 5.6537±0.9208 A a 0.5580±0.0889 B c 1.0177±0.8227 B c Xap1 1.4020±0.4816 A b 1.2427±0.7827 A ab 1.2340±0.4723 A b 2.0710±0.0472 A bc 2.3773±1.2117 A abc Xap2 0.4287±0.0443 A b 1.3307±0.2053 A ab 0.3050±0.0782 A b 0.8090±0.2286 A c 1.9133±0.1466 A bc KONTROL 3.0713±1.0961 A a 2.6937±1.1914 AB a 1.3710±0.2021 B b 2.7530±1.1330 AB b 2.7970±1.4061 AB ab LSD%5 (Çeşit*Bakteri*Zaman)= 1,529

A, B, Her çeşit ve patojen seviyelerinde zamanların karşılaştırılması a, b Her çeşit ve zaman seviyelerinde patojenlerin karşılaştırılması P. s. pv. phaseolicola=Psp

X. a. pv. phaseoli=Xap

0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 12 24 36 72 A

A-98/522 A-98/510 A-98/Kontrol

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 12 24 36 72 B 36-K/522 36-K/510 36-K/Kontrol 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 12 24 36 72 C

A-98/120 A-98/145 A-98/Kontrol

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 12 24 36 72 D 36-K/120 36-K/145 36-K/Kontrol

Şekil 4.6. Askorbat peroksidaz (APX) enzim aktivitesi, A; P. s. pv. phaseolicola (522-p ve 510-p) inokulasyonu sonrası Aras-98 fasulye çeşidi, B; P. s. pv. phaseolicola (522-p ve 510-p) inokulasyonu sonrası 36-K fasulye genotipi, C; X. a. pv. phaseoli (120-x ve 145-x) inokulasyonu sonrası Aras-98 fasulye çeşidi, D; X. a. pv. phaseoli (120-x ve 145-x) inokulasyonu sonrası 36-K fasulye genotipi zamana bağlı enzimatik reaksiyonların değişimi