Ben/Kahraman Bakış Açısı ve Anlatıcı

4.2.1 Isolados de C. albicans estocados em banco de micro-organismos

Foram analisadas 25 cepas de C. albicans selecionadas de uma coleção de culturas do Laboratório de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro, obtidas de 12 pacientes após a menarca, com quadro clínico compatível com CVV recorrente, excluindo-se do estudo pacientes com evidências clínicas de neoplasias malignas e AIDS.

As pacientes foram atendidas no ambulatório da Maternidade Escola Januário Cicco da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e em duas clínicas particulares durante o período de maio de2003 a maio de 2005 e dados das mesmas foram coletados em fichas clínicas gentilmente cedidas.

O projeto de pesquisa, conduzido pela professora do Departamento de Infectologia da UFRN, Eveline Pipolo Milan, foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN sob Cadastro 44/03 e todas as pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

A maioria das cepas de C. albicans selecionadas do banco de leveduras do Laboratório de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro compreenderam pares de isolados da região anal (colonização) e da região vaginal (infecção) obtidos da mesma paciente, bem como isolados vaginais obtidos ao longo de coletas realizadas sequencialmente em uma mesma paciente.

4.2.1.1 Verificação de viabilidade, pureza e identificação fenotípica dos isolados de C. albicans estocados em banco de micro-organismos

Previamente aos experimentos, as cepas estocadas no banco de micro- organismos foram submetidas à verificação de sua pureza e viabilidade. Para tanto, foram reativadas em meio YPD (“Yeast peptone dextrose”; extrato de levedura 10 g/L; dextrose 20g/L; peptona 20g/L) líquido, e incubadas em incubadoras rotatórias (TE-420 incubadora, Tecnal) a 37 °C por 48 h. Em seguida, foram semeadas em meio ágar Sabouraud dextrose (Sabouraud Dextrose Agar, DifcoTM, USA) contendo cloranfenicol (0,05 mg/mL; Arifenicol®, Ariston), incubando-se a 37ºC por 48 h.

Para avaliação da pureza, as leveduras foram semeadas com alça de níquel-cromo pela técnica de esgotamento, em placas de Petri (90x15 mm) contendo meio CHROMagar Candida® (CHROMagarTM Candida, Difco, USA), meio cromogênico seletivo, que permite a identificação de culturas mistas de leveduras. As placas foram incubadas a 37ºC ± 2 durante 24 a 72 h, sendo a positividade para C. albicans ou C. dubliniensis observada para as culturas que apresentaram colônias de coloração verde com diferentes intensidades (BAUMGARTNER, FREYDIERE, GILLE, 1996; WARREN, HAZEN, 1995).

As colônias oriundas do meio CHROMagar Candida® foram identificadas por microcultivo em ágar Fubá com tween 80 (fubá 40 g/L; ágar bacteriológico 20 g/L; Tween 80 12 mL/L) e pelo perfil bioquímico através de metodologia clássica (KURTZMAN, FELL, 1998; SIDRIM, ROCHA, 2004). Também foi realizada a triagem fenotípica de C. dubliniensis através dos testes de tolerância à temperatura de 42ºC (COLEMAN et al., 1997) e do caldo hipertônico (ALVES et al., 2002).

Com a finalidade de criar um banco de micro-organismos próprio para este estudo, todas as cepas foram cultivadas em meio YPD (“Yeast Peptone Dextrose”; extrato de levedura 10 g/L; dextrose 20g/L; peptona 20g/L) “overnight” a 30 ºC, estocadas em tubos de congelamento contendo 20% de glicerol e armazenadas em freezer a -80 ºC.

4.2.2. Isolados clínicos de C. albicans obtidos recentemente

4.2.2.1 População do estudo

Foram incluídas no estudo 10 mulheres após a menarca, sem neoplasias malignas ou AIDS, apresentando quadro clínico compatível com CVV esporádica ou recorrente, atendidas no ambulatório de ginecologia da Maternidade Escola Januário Cicco (MEJC) da UFRN ou no Laboratório Integrado de Análises Clínicas (LIAC) do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN no período de novembro de 2011 a agosto de 2012.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes sob o protocolo 595/11 (Anexo A). Todas as pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Apêndice A).

4.2.2.2 Coleta de dados

Dados completos destas pacientes foram obtidos mediante a aplicação de um questionário (Apêndice B). O questionário foi respondido com o auxílio da paciente e do ginecologista, no momento da coleta das amostras e após a assinatura do Termo de Consentimento.

4.2.2.3 Coleta das amostras

Foram coletadas amostras sequenciais de secreção anal e vaginal das pacientes com um intervalo de uma semana a um mês entre as coletas. A coleta da amostra clínica foi realizada pelo ginecologista quando a paciente foi atendida na MEJC, e por profissional habilitado quando a paciente foi atendida no LIAC.

A coleta foi realizada da seguinte maneira:

 Inseriu-se uma zaragatoa (“swab”) no introito vaginal ou no ânus, fazendo-se movimentos de rotação para coletar o material;

 A zaragatoa foi removida e inserida em um tubo contendo 2 mL de solução salina (0,9% de NaCl) com cloranfenicol (0,05 mg/mL; Arifenicol®, Ariston) estéril.

Para transporte do material, as amostras clínicas foram acondicionadas a 4ºC por até 24 horas e encaminhadas ao Laboratório de Micologia Médica e Molecular do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN, para posterior processamento das mesmas.

4.2.2.4 Processamento das amostras

A partir das amostras clínicas (secreção vaginal e secreção anal), realizou-se o exame direto, observando-se o sedimento obtido após centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos da suspensão das amostras em salina, aplicando-se 20 µL do mesmo sobre uma lâmina, cobrindo-se com lamínula e observando-se em microscopia óptica (Olympus CX21; 400 x de maginificação).

O material obtido das pacientes foi semeado nos seguintes meios de cultura: meio cromogênico e diferencial CHROMagar Candida (CHROMagarTM Candida, Difco, USA), com auxílio de “swab”, através da técnica dos sete pontos equidistantes com o intuito de isolar a levedura e detectar a possível presença de mais de uma espécie de Candida (cultura mista) através da coloração apresentada (BAUMGARTNER, FREYDIERE, GILLE, 1996); ágar Sabouraud-dextrose (Sabouraud Dextrose Agar, DifcoTM, USA) com cloranfenicol (0,05 mg/mL; Arifenicol®, Ariston) e rosa de bengala (0,025 mg/mL; Rosa de Bengala, Vetec) semeado por meio da adição de 100 µL da suspensão das amostras (secreção vaginal e secreção anal) em solução salina (0,9% de NaCl) obtida a partir da coleta, utilizando-se uma alça de Drigalski através da técnica de distensão, com o intuito de formar um filme homogêneo na superfície da placa que possibilitasse a contagem de colônias. As placas foram incubadas a 30C, durante 96 horas. Colônias de cores diferentes, ou ainda, colônias de mesma cor, mas que apresentaram características fenotípicas distintas (tamanho, textura, tonalidade), foram isoladas separadamente para que se procedesse à identificação. Determinou-se o

número de unidades formadoras de colônia (UFC) das leveduras crescidas em ágar Sabouraud-dextrose com cloranfenicol e rosa de bengala.

4.2.2.5 Armazenamento das leveduras isoladas

Com a finalidade de criar um banco de micro-organismos próprio para este estudo, todas as cepas de levedura foram cultivadas em meio YPD (“Yeast Peptone Dextrose”; extrato de levedura 10 g/L; dextrose 20g/L; peptona 20g/L) “overnight” a 30 ºC, estocadas em tubos de congelamento contendo 20% de glicerol e armazenadas em freezer a -80 ºC.

4.2.2.6 Critério de inclusão das leveduras isoladas

Foram inclusos no estudo apenas isolados clínicos de C. albicans, excluindo-se isolados de outras espécies de Candida ou de outros gêneros de levedura. Priorizou-se a inclusão de isolados de C. albicans que constituíam pares (isolado vaginal e isolado anal) obtidos simultaneamente da mesma paciente e/ou sequências obtidas do mesmo sítio (vaginal ou anal) ao longo de coletas realizadas sequencialmente em uma mesma paciente.