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5.2.1. Comparação da expressão gênica entre genótipos por oligoarranjos e qPCR

O estudo dos genes e das vias que regulam o acúmulo de sacarose e biomassa em cana-de-açúcar sempre atraiu grande interesse. Experimentos anteriores conduziram a prospecção de genes diferencialmente expressos em genótipos contrastantes para acúmulo de sacarose e biomassa (Papini-Terzi et al. 2009; Sato 2012) o que permitiu a obtenção de resultados importantes com a identificação de genes e possíveis mecanismos regulatórios envolvidos nessas características. No entanto, devido à base genética estreita das variedades comerciais e à diminuição dos ganhos de produtividade a cada nova variedade comercial lançada, torna-se importante explorar a grande diversidade genética do gênero Saccharum para identificar alvos de interesse que possam ser introduzidos nos programas de melhoramento, bem como obter um melhor entendimento das vias regulatórias para

direcionar o melhoramento genético. Nesse contexto, o perfil de expressão gênica de três espécies ancestrais e uma variedade comercial importante, RB867515, foi analisado utilizando-se microarranjo de oligonucleotídeos e qPCR. Nos oligoarranjos, a RB867515 foi usada como controle em todos os experimentos, desta forma, possibilitando comparações entre os genótipos. Os genótipos ancestrais podem ser fontes importantes de variabilidade genética com potencial para contribuir no aumento dos ganhos de produtividade e desenvolvimento da cana energia.

5.2.1.1. Metabolismo energético e de sacarose

De forma geral, os genes relacionados à geração de energia, tanto nos oligoarranjos (Seção 4.8.1) como nos experimentos de qPCR (seção 4.9.4), estão mais expressos em S.

spontaneum e menos expressos em S. officinarum. Genes como a fosfofrutoquinase (PFK,

SCSBFL1105F08.g) e uma subunidade da ATP-sintase (SCJLFL3014G01.g) estão induzidos em mais de um tecido em S. spontaneum (Apêndice 1). Ao contrário, a piruvato quinase (PK, SCCCLR1070D04.g) e a fosfoglicerato quinase (PGK, SCCCLR1079B06.g) estão reprimidas em entrenó imaturo e intermediário de S. officinarum. A indução de PK em S. spontaneum também é vista em entrenó intermediário nos experimentos de qPCR (Tabela 14). Vale ressaltar que estas quinases participam de etapas que envolvem gasto ou produção de ATP na glicólise, sendo os principais pontos de controle da via (Lehninger et al. 2005). O complexo I da cadeia de transporte de elétrons (NADH desidrogenase, SCMCLR1122H07.g) também está induzido em S. spontaneum nos três entrenós testados por qPCR (Tabelas 13- 15). Ainda, podemos observar a indução da expressão do antissenso desse mesmo SAS em entrenó de S. officinarum em relação à RB867515 nos oligoarranjos (Apêndice 1), o que pode indicar um silenciamento pós-transcricional desse gene no genótipo ancestral, sugerindo

novamente um menor gasto energético de S. officinarum. Isso pode ser explicado pela mesma hipótese de acúmulo precoce de sacarose em entrenós mais jovens, onde o fluxo de carbono é direcionado para estocagem em S. officinarum, enquanto que em RB867515 está direcionado para crescimento. Por outro lado, o maior gasto energético de S. spontaneum pode ser devido à produção de fibras lignificadas, uma vez que esse genótipo possui uma maior porcentagem de fibras lignificadas (Poelking 2012), e a lignina requer um maior input de energia para sua produção em comparação a carboidratos (Amthor 2003).

Da mesma forma observada nos experimentos de qPCR (Seção 4.9.4), genes do metabolismo de sacarose quase não apresentam um padrão entre plantas de alto e baixo brix, nem qualquer outro padrão de expressão aparente. Em todos os experimentos de microarranjo, apenas um gene relacionado ao metabolismo de sacarose foi identificado, em

S. officinarum, onde uma sacarose sintase (SCEQLB1065B01.g) está induzida em entrenó

intermediário.

Essa fraca correlação entre a expressão de genes do metabolismo de sacarose e seu acúmulo em cana-de-açúcar já foi relatada anteriormente, onde colmos em desenvolvimento com acúmulo de sacarose ativo não apresentam enriquecimento na expressão de genes de metabolismo de sacarose (Casu et al. 2003). Provavelmente, a falta de correlação entre o padrão de expressão de genes e o acúmulo de sacarose pode ser explicada pelo fato do metabolismo de sacarose em geral ser fortemente influenciado por modificações pós-traducionais, mediadas por proteínas regulatórias, como as quinases. Dentre elas, pode-se destacar as proteínas SnRKs, as quais controlam o metabolismo de carbono em plantas pela modulação da atividade enzimática por fosforilação direta e pela regulação da expressão gênica (Halford & Hey 2009). Enzimas como a sacarose sintase e sacarose-fosfato sintase são controladas direta ou indiretamente por SnRKs (Purcell et al.

1998; Sugden et al. 1999). Em cana-de-açúcar, já foi demonstrado uma associação entre a expressão de SnRKs e o acúmulo de sacarose, onde plantas com alto brix apresentavam maior expressão dessas quinases (Papini-Terzi et al. 2009).

O único gene que pode estar relacionado ao metabolismo de sacarose que apresenta uma correlação direta com o conteúdo de brix das plantas analisadas é uma SnRK interacting

prontein (SCACRZ3111E02.g) reprimida em entrenó imaturo e intermediário de S. spontaneum e S. robustum. Acredita-se que essa proteína atue inibindo a ação das SnRKs

(Thelander et al. 2007). Esse resultado eleva a complexidade da atuação das SnRKs no metabolismo de sacarose em cana-de-açúcar, uma vez que a observação de Papini-Terzi (Papini-Terzi et al. 2009) indica que a maior expressão de SnRKs correlaciona-se diretamente com o maior acúmulo de sacarose e, assim, seria esperado que uma proteína que inibe a ação de SnRKs estivesse induzida em variedades de baixo brix, e não reprimida, como observado nos genótipos ancestrais.

5.2.1.2. Transportadores

As aquaporinas, como descrito anteriormente, são proteínas que formam canais de membrana que facilitam o movimento de água e solutos entre células ou compartimentos celulares (Heinen et al. 2009). Em cana-de-açúcar, aquaporinas já foram identificadas com expressão diferencial em experimentos de variedades contrastantes para brix (Papini-Terzi

et al. 2009; Sato 2012) e os autores sugeriram uma possível associação entre a expressão

dessa proteína e o acúmulo de sacarose. Em experimentos de seca (Costa 2012; Lembke et

al. 2012), as aquaporinas também aparecem diferencialmente expressas. Recentemente, foi

reportado que bananeiras transgênicas superexpressando aquaporinas apresentam um melhor desempenho contra diversos tipos de estresses abióticos (Sreedharan et al. 2013),

demonstrando que essas proteínas são, de fato, interessantes para o melhoramento genético, principalmente, no caso da produção de cana energia, onde o cultivo em regiões menos adequadas é uma característica relevante.

Além disso, aquaporinas estão envolvidas no processo de expansão celular (Chen et

al. 2013), podendo ser interessante no aumento da biomassa vegetal e, consequentemente,

melhorando a produtividade, agregando mais uma característica significativa. Nos 3 genótipos ancestrais, pelo menos uma aquaporina apresentou expressão diferencial em todos os tecidos analisados por oligoarranjos (Apêndice 1), sugerindo que, também em cana- de-açúcar, essas proteínas podem estar associadas à expansão do colmo, além do acúmulo de sacarose. Nos experimentos de qPCR, é possível observar uma correlação mais clara, onde as plantas de baixo brix, principalmente S. spontaneum, apresentam maior expressão de aquaporinas nos entrenós (Tabelas 13-15) e folha (Tabela 17). Já foi demonstrado que as aquaporinas localizam-se nas células guarda de diversas espécies, incluindo gramíneas (Heinen et al. 2009) e, uma vez que a abertura e fechamento dos estômatos são controlados pela pressão osmótica nas células guarda (Heinen et al. 2009), é provável que as aquaporinas influenciem diretamente o turgor celular e, consequentemente, a abertura dos estômatos. Assim, é possível que a expressão de aquaporinas possa ter alguma relação direta ou indireta nas diferenças apresentadas por S. spontaneum para os parâmetros de trocas gasosas em folha (Figura 9), como transpiração e condutância estomática (Gs). De fato, em experimentos com videiras submetidas a estresse hídrico moderado mostraram uma correlação entre a expressão de aquaporinas, Gs e condutância hidráulica da folha (Pou

et al. 2012). Em outro estudo, plantas de arroz submetidas a estresse hídrico severo

mostraram um aumento considerável de aquaporinas no proteoma da planta (Mirzaei et al. 2012). Esses resultados sugerem um papel importante das aquaporinas nas respostas à seca