Azerbaycan’ın Dış Ticaret Mevzuatı ve Dış Ticaret Anlaşmaları

Além dos genes, a identificação de promotores associados a características de interesse também é importante para se alcançar o fenótipo pretendido através da manipulação genética. Desse modo, foram escolhidos alguns SAS com padrão de expressão bem característico nos clusters hierárquicos (Figuras 24, 26-28), com expressão distinta em

S. spontaneum e S. officinarum, e seus promotores foram buscados no genoma de cana-de-

açúcar nos banco de dados de sequenciamento do whole genome shotgun e dos BACs, como descrito na metodologia (Seção 3.15). Os genes foram selecionados principalmente nos clusters onde S. spontaneum apresentava maior expressão, uma vez que esse genótipo parece ter o desenvolvimento precoce de parede celular secundária em relação às demais plantas analisadas. Assim, fatores da família NAC e MYB com esse perfil de expressão podem ser bons candidatos à reguladores desse processo, como ocorre em outras espécies. Além desses TFs, também foram selecionados genes da via de fenilpropanoides (CAD, COMT, CCoACOMT, C4H, F5H, PAL, 4CL e CCR) e o gene de função desconhecida kobito. Para os genes com expressão detectada do transcrito antissenso, foram buscadas ambas as se u iasà à jusa teà doà à ua toà à o ta teà doà do transcrito. Das 36 sequências escolhidas, para 25 não foi possível identificar nenhuma sequência promotora. Nas demais, conseguiu-se identificar 9 SAS com sequência promotora do transcrito senso, 1 SAS apenas com sequência promotora do antissenso e 1 SAS com ambas. Dentre esses SAS, temos apenas os genes COMT, kobito e TFs NAC e MYB. De forma semelhante, foram buscados os promotores (apenas senso) dos SAS homólogos aos de milho identificados pela análise de coexpressão encontrando-se apenas para 10 SAS dos 46 presentes na lista (Tabela 18),

sendo de 6 categorias diferentes. Em todos os casos, a sequência da região promotora foi limitada em 1,5kb. Entretanto, devido ao tamanho relativamente curto dos contigs do

shotghun, a sequência promotora identificada na maior parte dos casos possuía tamanho

entre 200 e 400 nt (Tabela 19 e 20).

Para verificar a presença nos promotores de sítios de ligação de fatores de transcrição relacionados ao metabolismo de parede celular secundária, as sequências foram analisadas utilizando-se a ferramenta FIMO (Grant et al. 2011) buscando-se pelos elementos regulatórios SNBE (Zhong et al. 2010), SMRE (Zhong & Ye 2012) e M46RE (Kim et al. 2012), os quais se ligam aos TFs da família NAC, MYB e ao AtMYB46, respectivamente (Tabela 19 e 20). Essa análise, além de caracterizar parcialmente esses promotores, acrescenta uma evidência importante da possível participação dos genes da análise de coexpressão (Figura 31) nesse processo biológico, dando uma maior confiabilidade a esses dados. Tanto os sítios de ligação que possuem a sequência consenso perfeita quanto aqueles com 1 mismatch foram contabilizados (Tabela 19 e 20).

Nos genes escolhidos nos clusters hierárquicos (Tabela 19), o sítio de ligação M46RE aparece apenas em poucos genes, como o MYB SCCCCL3004A05.b e o NAC SCJFRZ2014D06.g. Já o SMRE aparece em mais ocasiões, estando presente nos promotores da COMT, 3 MYBs (SCCCCL3004A05.b, SCEQRT2027F03.g e SCMCRT2105F02.g) e 1 NAC (SCJFRZ2014D06.g). O gene COMT de milho também possui SMREs em seu promotor (Fornale et al. 2010) diferentemente da COMT de Arabidopsis, a qual não possui SMREs (Raes et al. 2003; Fornale et al. 2010), sugerindo uma divergência entre gramíneas e Arabidopsis. Os SNBEs estão presentes em promotores de 1 MYBs (SCCCCL3004A05.b) e 1 NAC (SCACLR2007C06.g), sugerindo que estes possam ser constituintes do segundo nível de regulação, alvos diretos dos SWNs. A presença desses sítios de ligação ajudam a dar suporte

à hipótese na qual esses TFs possam ser reguladores biossíntese da parede celular secundária. O promotor de transcrito MYB antissenso (SCACST3159E04.g) apresenta 4 SNBEs, mesmo sendo uma sequência curta (300 nt). Isso levanta a hipótese que a regulação da biossíntese de parede celular secundária possa ter influencia de mecanismos via antissenso. Para o MYB SCJLRZ1019A02.g, homólogo do AtMYB58/63, nenhum sítio de ligação foi identificado nos 1500 nt do promotor. O mesmo acontece com kobito, mas, diferentemente de SCJLRZ1019A02.g, possui apenas 200 nt de sequência promotora identificada.

Tabela 19. Número de cis-elementos de parede celular nos promotores dos genes escolhidos pelos clusters hierárquicos (Figuras 24, 26-28). AS, antissenso.

SAS Categoria Anotação Tamanho M46RE* SMRE* SNBE*

SCEQLB2018G06.g Cell wall Metabolism AS - COMT 745 nt 0 (6) 0 (11) 0 (5) SCEQLB2018G06.g Cell wall Metabolism COMT 1500 nt 0 (21) 3 (34) 0 (33) SCACST3159E04.g Signal transduction AS - MYB 300 nt 0 (3) 0 (10) 4 (0) SCCCCL3004A05.b Signal transduction MYB 900 nt 1 (3) 1 (10) 2 (14) SCEQRT1030H12.g Signal transduction MYB 600 nt 0 (5) 0 (7) 0 (11) SCEQRT2027F03.g Signal transduction MYB 300 nt 0 (1) 1 (0) 0 (3) SCJLRZ1019A02.g Signal transduction ScMYB45 1500 nt 0 (14) 0 (21) 0 (33) SCMCRT2105F02.g Signal transduction MYB 214 nt 0 (1) 1 (5) 0 (2) SCACLR2007C06.g Signal transduction NAC 450 nt 0 (0) 0 (1) 5 (0) SCCCRZ1004G12.g Signal transduction NAC 650 nt 0 (2) 0 (5) 0 (9) SCJFRZ2014D06.g Signal transduction NAC 1500 nt 3 (13) 6 (22) 0 (21) SCMCRT2087B09.g Unknown function Kobito 200 nt 0 (2) 0 (2) 0 (4) *Número de cis-elementos identificados com sequência que se encaixa no consenso. Números entre parênteses indicam o número de cis-elementos identificados com 1 mismatch em relação ao consenso.

Nos promotores dos genes coexpressos com 4CL (Tabela 20), apenas os genes com sequências promotoras curtas (<350 nt) não apresentaram algum dos 3 sítios de ligação analisados. Genes da via de lignina (CCR e PAL) e um gene envolvido na formação de precursores de carboidratos de hemicelulose, UDP-glicose desidrogenase, apresentaram SNBEs e, principalmente, sítios de ligação de fatores MYB (Tabela 20). Uma Akyrin-kinase like

apresentou sítios M46RE e SMRE; o MYB SCJFRZ2015F02.g apresenta 3 sítios SNBEs, sugerindo que possa ser alvo dos SWNs (Tabela 20), assim como alguns MYBs da Tabela 19. Curiosamente, uma proteína com função desconhecida apresenta os três sítios analisados (Tabela 20). Assim, essa proteína se torna um alvo interessante para análises posteriores para comprovar um envolvimento na biossíntese de parede celular secundária.

Tabela 20. Número de cis-elementos de parede celular nos promotores dos genes da lista de coexpressos (Tabela 18).

SAS Categoria Anotação Tamanho M46RE* SMRE* SNBE*

SCSGLR1045E04.g Carbohydrate Metabolism Beta-1,3- galactosyltransferase 265 0 (2) 0 (2) 0 (1) SCQGLR1019G02.g Carbohydrate Metabolism UDP-glucose dehydrogenase 1014 6 (5) 4 (18) 2 (16) SCBFRT1064A01.g Cell wall

Metabolism CCR 1157 7 (8) 6 (21) 1 (20) SCJLRT1013C01.g Cell wall Metabolism PAL 1523 2 (21) 4 (43) 3 (32) SCBFLR1083F12.g Lipid metabolism 3-hydroxyisobutyryl- CoA hydrolase 350 0 (1) 0 (7) 0 (2)

SCEZLB1013G06.g Others Ankyrin kinase-like 264 1 (1) 1 (2) 0 (2) SCSFRT2072D04.g Others Tify motif family

protein 310 0 (0) 0 (1) 0 (0)

SCJFRZ2015F02.g Signal

transduction Myb-like domain 1256 1 (12) 1 (20) 3 (18) SCSGST3118D04.g Unknown Hypothetical protein 1539 4 (13) 4 (31) 3 (32) *Número de cis-elementos identificados com sequência que se encaixa no consenso. Números entre parênteses indicam o número de cis-elementos identificados com 1 mismatch em relação ao consenso.

4.12. Construção de bibliotecas de cDNA full length e análise do transcriptoma de