C. TAZMİNAT TALEBİ
3. Ayıplı Mal ve Hizmet Dolayısıyla Tazminat Talebi
Neste tipo de medida, o procedimento experimental usado é exatamente o mesmo descrito na seção 4.4, ou seja, realizamos medidas de estiramento dos complexos DNA-psoralen, obtendo a curva de força × extensão do complexo. Para estudar a elasticidade dos complexos DNA-psoralen em cada situação distinta (intercalação, monoaductos e crosslinks), usamos o seguinte proce- dimento:
(a) Sem iluminar a amostra com luz ultravioleta, medimos o comprimento de persistência e de contorno dos complexos realizando um experimento de estiramento idêntico ao descrito na seção 4.4.
(b) Iluminamos a amostra com luz UVA durante um tempo suficiente para que todos os crosslinks possíveis sejam formados. Para a intensidade da luz usada, constatamos após alguns testes que esse tempo é de cerca de 30 minutos. A fonte de luz usada é uma lâmpada de mercúrio (Nikon LH- M100C-1). Para iluminar a amostra apenas com a componente UVA, usamos um filtro passa-faixa centrado em 365 nm e com largura de faixa de 10 nm (Edmund Optics). Repetimos então as medidas, obtendo os comprimentos de persistência e de contorno para esta situação.
(c) Após a etapa (b) iluminamos a amostra com luz UVB utilizando a mesma lâmpada e um filtro passa-faixa centrado em 266 nm e com largura de faixa de 10 nm (Newport). Neste caso, de acordo com a ref. [62], todos os crosslinks seriam destruídos e teríamos apenas monoaductos. Repetimos novamente as medidas, obtendo os novos valores dos comprimentos de per- sistência e de contorno para esta situação.
Repetimos este procedimento para duas concentrações diferentes de pso- ralen. Os resultados para o comprimento de persistência estão sumarizados na Tabela 5.1.
Iluminação A (CP = 8,1 µM) A (CP = 13,4 µM)
Luz verde (λ = 500±20 nm) 64 ± 6 nm 86 ± 8 nm
Luz azul (λ = 450±20 nm) 67 ± 7 nm -
UVA 107 ± 10 nm 116 ± 13 nm
UVB (após UVA) 34 ± 3 nm 93 ± 9 nm
Tabela 5.1: Resultados das medidas de equilíbrio para o comprimento de
persistência dos complexos DNA-psoralen.
A situação de intercalação corresponde à iluminação com luz verde e azul. Usamos este tipo de iluminação apenas para visualizar a amostra e realizar as medidas, pois sabemos que a luz visível não tem influência na formação de monoaductos ou crosslinks. Para a primeira concentração de psoralen
usada (CP = 8,1 µM), obtemos um comprimento de persistência na faixa de
∼ 65 nm, ligeiramente maior que o da molécula de DNA livre de fármacos
(∼ 50 nm). Para a segunda concentração usada (CP = 13,4 µM), o valor
a intercalação do psoralen aumenta a rigidez do complexo nesta faixa de concentração estudada.
Quando iluminamos a amostra por cerca de 30 minutos com luz UVA,
obtemos um comprimento de persistência da ordem de ∼ 107 nm (CP = 8,1
µM) e ∼ 116 nm (CP = 13,4 µM), ou seja, mais de duas vezes maior que
o valor do DNA puro. Observe que estes valores correspondem à situação onde todos os crosslinks possíveis foram formados. Em outras palavras, os crosslinks aumentam ainda mais a rigidez do complexo nesta faixa de con- centração.
Finalmente, quando iluminamos a amostra com UVB (após UVA), se- gundo Ussery et al. [62], destruímos todos os crosslinks, obtendo apenas monoaductos. Em ambas as concentrações, o valor obtido é menor do que a situação com crosslinks. Se considerarmos correta a afirmação de Ussery et al. [62], isto implica que os monoaductos diminuem a rigidez do complexo
em relação aos crosslinks. Para CP = 8,1 µM, obtemos um comprimento de
persistência extremamente baixo, da ordem de ∼ 34 nm. Para CP = 13,4
µM, o valor é bem mais alto, ∼ 93 nm, porém ainda abaixo do valor medido
para a situação com crosslinks. Entretanto, não temos certeza se a afirmação de Ussery et al. [62] é verdadeira, pois existem outros autores como Shi et al. [80] que afirmam que a luz UVB pode também destruir os monoaduc- tos. Na realidade, estes autores afirmam que existem dois tipos possíveis de monoaductos: Mfu (furan-side monoadduct) e Mpy (pyrone-side monoad- duct). A diferença entre os dois está na ligação química covalente entre a pirimidina e o anel do fármaco, que ocorre em átomos diferentes. Segundo Shi et al. [80] e Eichman et al. [81], apenas um dos tipos de monoaducto (o Mfu) forma crosslinks com facilidade. Ainda, segundo Shi et al. [80] e Cimino et al. [78], ambos os tipos de monoaductos podem ser revertidos com luz UVB (com preferência de reversão para o Mpy), contrariando Ussery et al. [62]. Talvez isto explique a grande discrepância observada entre os valores do comprimento de persistência dos complexos da última linha da Tabela 5.1: pode estar ocorrendo maior formação de um certo tipo de monoaducto num caso do que no outro.
A seguir, na Fig. 5.3, mostramos os resultados obtidos nas situações de intercalação (círculos) e de crosslinks (quadrados) para outras concentrações
através do gráfico do comprimento de persistência em função da concentra- ção total do fármaco em solução, de maneira semelhante ao apresentado no Capítulo 4 para os fármacos intercalantes. Observe que o comprimento de persistência sofre o mesmo tipo de transição abrupta discutida no Capítulo 4. É interessante notar que esta transição ocorre na mesma concentração (CP = 13,4 µM) tanto para a situação de intercalação quanto para a situação de crosslinks. Esta concentração crítica corresponde à terceira coluna da Tabela 5.1. O comportamento do comprimento de persistência em função da concen- tração é qualitativamente idêntico para ambas as situações: cresce monotoni- camente até atingir a concentração crítica, quando sofre uma queda abrupta e permanece praticamente constante a partir daí, no valor ∼ 50 nm. Observe que, antes da transição, o comprimento de persistência dos complexos com crosslinks é sempre maior que o dos complexos com o fármaco intercalado. Entretanto, após a transição, as duas situações possuem aproximadamente o mesmo valor do comprimento de persistência (∼ 50 nm), estando a pequena diferença situada dentro da barra de erro do experimento.
Na Fig. 5.4 apresentamos o comportamento do comprimento de contorno em função da concentração do fármaco para os mesmos complexos da Fig. 5.3, na situação de intercalação. Não apresentamos os resultados referentes aos complexos com crosslinks por causa da grande barra de erro do experi- mento na determinação de L, um problema já discutido no Capítulo 4. Neste caso, os valores de L para os complexos com crosslinks estariam dentro da barra de erro mostrada na Fig. 5.4.
Da mesma forma que fizemos no Capítulo 4 para os fármacos interca- lantes, podemos usar os resultados da Fig. 5.4 para estimar o número de exclusão n para o psoralen no processo de intercalação. Na saturação, ob- temos o valor do comprimento de contorno (média dos valores dos quatro
últimos pontos da Fig. 5.4) Ls = 23,5 µm. O número de moléculas de pso-
ralen intercaladas na saturação é então Ns
i = (23,5 - 16,5) µm/0,34 nm ∼
20590 moléculas. Finalmente, teremos n = Npb/Ns
i = 48500/20590 ∼ 2,4.
Para realizar este cálculo, usamos o dado de Ussery et al. [62], que afirma que cada molécula intercalada de psoralen aumenta o comprimento de contorno de 0,34 nm. Não encontramos na literatura o valor do número de exclu- são para o nosso composto específico (Furo[3,2-g]Coumarin). Para outros
Figura 5.3: Comprimento de persistência em função da concentração do fár- maco para complexos DNA-psoralen. Observe que a transição abrupta ocorre
na mesma concentração (CP = 13,4 µM) para ambas as situações. Círculos:
complexos intercalados; Quadrados: complexos com crosslinks.
derivados do psoralen, são reportados valores de n que variam entre 1,0 e 3,5 [72,82].
Por fim, podemos usar o mesmo procedimento discutido no Capítulo 4 (seção 4.5.3) para ajustar nossos dados experimentais da Fig. 5.4 ao mo- delo de exclusão de vizinhos. A Fig. 5.5 mostra o resultado obtido. Nesta figura, os círculos correspondem aos dados experimentais, enquanto a linha pontilhada corresponde ao ajuste com o modelo de exclusão de vizinhos, Eq. 4.7. Deste ajuste, determinamos o número de exclusão n = 1,4 ± 0,2 e a constante química Ki = 8,8 × 103 M−1. Entretanto, devido às barras de erro relativamente grandes desta medida, precisaríamos realizar um experimento com uma única molécula de DNA, variando a concentração na amostra, para verificar estes números, conforme discutimos no Capítulo 4. Acreditamos que o valor de n determinado na estimativa anterior (2,4) seja mais confiável do que este determinado pelo ajuste.
Figura 5.4: Comprimento de contorno em função da concentração do fár- maco para os mesmos complexos DNA-psoralen da Fig. 5.3 na situação de intercalação.