Avrupa İnsan Hakları Sözleşmesi'nin Türk Hukukundaki Yeri

Os marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) são produtos de uma técnica baseada no método de amplificação de DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) (Reddy et al., 2002). Esta metodologia foi originalmente descrita, com pequenas variações e diferentes denominações, pelos trabalhos de Zietkiewicz et al. (1994), Gupta, et al. (1994) e Wu et al. (1994). Basicamente, a técnica envolve a amplificação de regiões entre seqüências de microssatélites adjacentes, inversamente orientadas. Os primers são baseados nas próprias seqüências repetitivas (com motivos di, tri, tetra ou penta nucleotídeos) proporcionando amplo arranjo de possíveis produtos amplificáveis (Zietkiewicz et al., 1994). Nenhum conhecimento a priori do genoma é necessário e primers baseados numa seqüência repetitiva, tal como (CA)n, podem ser desenhados considerando apenas o motivo existente na

própria seqüência tais como (CA)8 ou (CA)9 (Gupta et al., 1994; Bornet e

Branchard, 2001) ou com uma ancoragem, formada por um pequeno segmento de bases arbitrárias e/ou degeneradas, localizado em uma das extremidades (3’ ou 5’) da seqüência repetitiva, tais como (CA)8RG e (CA)8YT ou BDB(CA)7

(onde R=purinas, Y=pirimidinas, B=C, G ou T e D=A, G, ou T) (Zietkiewicz et al., 1994; Godwin et al., 1997, Fang et al., 1997, Reddy et al., 2002).

Considerando a ubiqüidade das seqüências microssatélites nos genomas dos eucariotos, o resultado da amplificação por primers ISSR é um sistema de marcadores multilocos útil para fingerprinting, análises de filogenia e diversidade, mapeamento e etiquetagem gênica e análises de biologia evolutiva (Godwin, et al., 1997; Reddy et al., 2002). Para que a amplificação de locos ISSR tenha sucesso, os pares de seqüências repetitivas devem ocorrer dentro de uma distância suficientemente curta, que possa ser amplificada pela

reação de PCR e os seus produtos separados em géis padrões de agarose ou poliacrilamida (Zietkiewicz et al., 1994, Gupta, et al., 1994; Godwin, et al., 1997; Reddy et al., 2002).

De acordo com Reddy et al. (2002), as fontes de variabilidade e o nível de polimorfismo detectado através dos marcadores ISSR, são decorrentes dos seguintes fatores: a) elevada taxa de mutação das seqüências microssatélites, alvos do anelamento do primer empregado; b) natureza do primer utilizado, isto é, seqüência repetitiva ou motivo, existência ou não de região de ancoragem, assim como localização (5’ ou 3’), extensão e composição da seqüência de ancoragem; d) método de resolução utilizado, isto é, gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE) em combinação com marcação radiativa ou coloração com nitrato de prata ou gel de agarose, corado com brometo de etídeo.

Segundo Blair et al. (1999), se a distribuição das diferentes seqüências microssatélites é aleatória, o número de bandas produzidas por um primer ISSR, de um dado motivo, deveria ser o reflexo deste motivo em um dado genoma. Dessa forma, tal situação forneceria uma estimativa da abundância de diferentes motivos, a partir de uma biblioteca de hibridização, e auxiliaria na seleção de motivos-alvos para o desenvolvimento futuro de marcadores de microssatélites.

O número de trabalhos utilizando marcadores ISSR tem sido crescente desde as primeiras publicações sobre a técnica. Esta classe de marcadores combina a maioria das vantagens dos marcadores AFLP, microssatélite, e RAPD, como elevado grau de reprodutilibidade dos dois primeiros e baixo custo, simplicidade e universalidade, do último (Godwin, et al., 1997; Fang et al., 1997, Bornet e Branchard, 2001; Reddy et al., 2002). A alta reprodutibilidade é resultante do comprimento dos primers empregados (16 a 25 pb) e de condições de anelamento mais estrigentes (com temperaturas entre 45°C e 60°C), enquanto o baixo custo e a simplicidade são em decorrência dos primers serem universais e livres de patenteamento, assim como da possibilidade de utilização sistemas de resolução que dispensam o uso de radiatividade, como o gel agarose corado com brometo de etídeo. Reddy et al. (2002) discutem as aplicações, relacionando diversos exemplos, desta classe de marcadores no melhoramento de plantas cultivadas. Por outro lado, uma parcela significativa dos trabalhos encontrados na literatura atual

envolve a aplicação dos marcadores ISSR na análise genética de espécies silvestres, sejam elas aparentadas ou não de espécies de plantas cultivadas. Estes trabalhos envolvem estudos de diversidade genética intra e interespecíficas de acessos ou genótipos, assim como análise da estrutura genética entre e dentro de populações naturais.

Huang e Sun (2000) avaliaram a diversidade e as inter-relações de acessos de batata doce (Ipomoea batatas) e de outras nove espécies silvestres relacionadas, utilizando marcadores ISSR e DNA do cloroplasto. De acordo com os autores, as análises filogenéticas, conduzidas com os dois tipos de marcadores, produziram resultados semelhantes, entretanto o elevado nível de polimorfismo exibido pelos marcadores ISSR resultou em melhor separação dos acessos ao nível infra-específico. Análise de diversidade e relações filogenéticas, utilizando marcadores ISSR, foi realizada no gênero Oryza por Joshi et al. (2000). O trabalho envolveu 17 espécies de arroz selvagem e duas cultivadas (O. sativa e O. glaberrima), além de espécies de outros três gêneros relacionados, perfazendo um total de 42 genótipos avaliados. O emprego de 11

primers polimórficos e informativos possibilitou o agrupamento dos genótipos

de acordo com seus respectivos genomas, além de revelar a existência de 87 marcas espécies e/ou genoma específicos para oito dos nove genomas existentes em Oryza e sugerir um padrão evolutivo polifilético para o gênero.

Estudos com marcadores ISSR envolvendo a caracterização de acessos pertencentes a uma única espécie foram realizados por Fang et al. (1997), que avaliaram 48 acessos de Poncirus trifoliata da coleção de Citrus da Universidade da Califórnia; Blair et al. (1999), que analisaram 58 acessos representativos da diversidade de arroz cultivado (Oriza sativa); Eiadthong et al. (1999), que investigaram a divergência entre 22 cultivares de manga (Mangifera indica), plantados na Tailândia; Assefa et al. (2003), que estudaram a divergência genética de 92 genótipos do cereal Eragrostis tef, originários de oito regiões diferentes da Etiópia. Em todos estes trabalhos, o nível de polimorfismo acessado foi considerado satisfatório pelos autores, possibilitando a distinção entre genótipos, individualmente e por grupo de afinidade, na quase totalidade dos casos. Os dados observados também foram compatíveis com os resultados obtidos de outros estudos, quando os mesmos materiais foram

investigados através de outros tipos de marcadores moleculares, como isoenzimas, RAPD, RFLP e AFPL.

Os marcadores ISSR também têm sido utilizados com sucesso em estudos de diversidade e estrutura genética de populações naturais de espécies silvestres, tais como mangue (Aegiceras corniculatum) da costa da China (Ge e Sun, 1999); amora (Morus serrata) na Índia (Vijayan et al., 2004); café (Coffea arabica) na Etiópia, (Aga et al., 2005); leguminosas do gênero

Ammopiptanthus do deserto do Noroeste da China (Ge et al., 2005) e de três

espécies de montana (Symplocos lauriana, Gaultheria fragrantissima e Eurya

nitida), endêmicas da região de Western Ghats da Índia (Deshpande et al.,

2001).