Técnicas multilocos de fingerprinting de DNA, baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR), tais como RAPD (random amplified polymorphic
DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism) e ISSR (inter-simple sequence repeats), apresentam enorme valor nos estudos de variação genética
de populações naturais, uma vez que elas proporcionam a geração de grande quantidade de dados de maneira rápida e relativamente fácil (Krauss, 2000), além de prescindir de qualquer conhecimento prévio do genoma da espécie ou populações analisadas. Por outro lado, apesar das vantagens citadas a análise desse tipo de marcador apresenta alguns problemas de ordem prática, sendo o principal deles o fato de não ser possível distinguir, diretamente, os genótipos heterozigotos dos homozigotos dominantes, ou seja, se um haplótipo ou “alelo” de um sítio de RAPD é amplificado, não é possível distinguir entre o loco homozigoto marcador/marcador (situação em que são amplificados os fragmentos dos dois haplótipos do indivíduo) e o heterozigoto marcador/ loco
nulo (situação em que ocorre a amplificação de apenas um dos haplótipos do indivíduo) (Lynch e Milligan, 1994).
Uma estratégia alternativa é a análise de progênies ou de tecido haplóide (como o macrogametófito de coníferas), de cada indivíduo que apresenta o alelo dominante. Entretanto tal estratégia amplia significativamente o volume de trabalho laboratorial e, mais importante ainda, em muitos casos não se dispõe de tais progênies e/ou tecidos haplóides (Zhivotovsky, 1999). Por isso, segundo Krauss (2000), três soluções, de natureza estatística, têm sido propostas para contornar este problema:
a) A freqüência do alelo nulo, para um dado loco, pode ser estimada através da raiz quadrada da freqüência do genótipo homozigoto nulo (banda ausente no gel), assumindo equilíbrio de Hardy-Weinberg na população e/ou loco;
b) Aplicação da metodologia proposta por Lynch e Milligan (1994), cujo propósito principal é reduzir o viés das estimativas obtidas, pelo método da raiz quadrada. Para isto, a análise ignora os locos cujas freqüências de indivíduos homozigotos nulos não excedam a três e utiliza estimadores de parâmetros populacionais obtidos pela expansão, de segunda ordem, da série de Taylor;
c) Utilização de uma abordagem Bayesiana, proposta por Zhivotovsky (1999), na estimação da freqüência dos alelos nulos.
As três metodologias relacionadas assumem, de algum modo, que o coeficiente de endogamia intrapopulacional é conhecido (Holsinger et al., 2002). Uma outra metodologia, amplamente utilizada atualmente, é AMOVA (analysis of molecular variance) desenvolvida por Excoffier et al. (1992). Neste caso, os dados fenotípicos multilocos, de cada indivíduo, são tratados como haplótipos e utilizados na construção de matrizes que descrevem a distância entre haplótipos na análise de variância molecular (Holsinger et al., 2002).
A analise de variância molecular (AMOVA) foi concebida como uma extensão dos trabalhos de Cockerham (1973) e de Long (1986), para a correlação alélica entre demes, para dados de diversidade entre haplótipos. Dessa forma, partindo do pressuposto que uma soma de quadrados convencional pode ser escrita como uma soma de quadrados das diferenças entre todos os pares de observações, Excoffier et al. (1992) elaboraram uma
análise hierárquica da variância molecular diretamente da matriz de quadrados de distâncias entre todos os pares de haplótipos, produzindo estimativas de componentes de variância análogas às estatísticas F de Wright, denominadas de “estatísticas Φ ”. O método é flexível para acomodar diversos tipos de matrizes, correspondentes a diferentes tipos de dados moleculares e/ou pressuposições evolutivas, sem necessidade de mudança na estrutura básica da análise.
O termo haplótipo, empregado neste contexto, refere-se à combinação de marcadores moleculares presentes em alguma área definida do genoma. Assim, o haplótipo de um indivíduo é representado por um vetor p, com valores 1, se a banda homóloga estiver presente e 0, caso contrário, enquanto um marcador, pode ser um fragmento de restrição/amplificação, um nucleotídeo ou um evento mutacional (Excoffier et al.,1992).
Considerando o caso em que os indivíduos amostrados são oriundos de diferentes populações, arranjadas em grupos, definidos a priori por um critério não genético, os haplótipos podem ser representados pelo modelo linear:
ijk jk k
ijk x a b c x = + + +
onde xijk é a freqüência do vetor do i-ésimo haplótipo, da j-ésima população no
k-ésimo grupo, x é o valor esperado desconhecido de xijk, a é efeito de grupos,
b é efeito de populações e c de indivíduos ou haplótipos. Tais efeitos são assumidos como sendo aditivos, aleatórios, não correlacionados, associados aos componentes de variância σ2a, σ2b e σ2c, respectivamente, que são
utilizados na obtenção das estatísticas Φ
2 2 2 σ σ σa b ST + = Φ , 2 2 σ σa CT = Φ , 2 2 2 c b b SC σ σ σ + = Φ onde 2 2 2 2 b b a σ σ σ
σ = + + ; Φ é correlação entre pares de haplótipos aleatórios ST dentro de populações, em relação à correlação de pares de haplótipos tomados ao acaso da espécie como um todo; Φ é a correlação entre haplótipos CT dentro de cada grupo de populações, em relação à de pares de haplótipos tomados ao acaso da espécie como um todo e Φ é correlação da SC diversidade molecular entre haplótipos aleatórios dentro das populações,
relativa à correlação entre pares de haplótipos tomados ao acaso dentro de uma região (Excoffier et al.,1992).
Originalmente, a metodologia da AMOVA foi desenvolvida para aplicação em sistemas haplóides (mtDNA) constituídos de um único grupo de ligação. Posteriormente, Michalakis e Excoffier (1996), descreveram estimadores para dados multilocos de microssatélites em sistemas diplóides. Os autores sugeriram manipular os genótipos dos indivíduos como dois haplótipos distintos, por isso, seria necessário conhecer a fase gamética e/ou que os marcadores fossem codominantes. Entretanto, Huff et al. (1993) aplicaram a metodologia original de Excoffier et al. (1992), na análise de diversidade de populações de uma espécie alógama obrigatória de gramínea (Buchoë dactyloides), genotipadas com marcadores RAPD, decompondo a variação total observada em componentes devido às diferenças entre indivíduos dentro de populações, entre populações dentro de regiões adaptativas e entre regiões. A partir daí este método tornou-se um dos mais utilizados, para partição da variabilidade genética, em trabalhos envolvendo populações naturais avaliadas com marcadores moleculares de herança dominante (Nybom, 2004). Posteriormente, modelos com decomposição da variação total, específicos para diversos tipos de dados, incluindo dados genotípicos com alelos recessivos e fase gamética desconhecida, foram incorporados ao aplicativo computacional empregado na execução da AMOVA (Schneider et al., 2000).
Diferentes métodos para obtenção da matriz de distância têm sido utilizados, destacando-se o quadrado da distância euclidiana, distância de Nei e Li e distância de Jaccard, mas todos eles produzem resultados praticamente idênticos na análise de variância molecular, quando aplicados ao mesmo conjunto de dados (Nybom, 2004). A significância dos componentes de variância e das estatísticas Φ são testadas através de análise de permutação (Excoffier et al., 1992). Neste caso, uma distribuição nula é computada por reamostragem dos dados, de modo que, a cada permutação, cada indivíduo é alocado aleatoriamente dentro da população, mantendo-a de tamanho constante. A repetição do processo diversas vezes possibilita a construção de uma distribuição nula, que será utilizada na estimação do grau de significância da estatística obtida.
O método da AMOVA apresenta uma relação direta com as estatísticas
F, estando sujeito às mesmas limitações das pressuposições assumidas pelo
modelo proposto por Cockerham (1973). É assumido que os acasalamentos ocorram completamente ao acaso e que não há endogamia. Caso contrário, o nível de heterozigose será inferior e a variabilidade poderá não ser convenientemente estimada. Em razão da deriva genética, fica difícil assumir que qualquer haplótipo seja representativo da variação completa do genoma. Também é importante que os dados sejam derivados de um número adequado de marcadores moleculares. Os efeitos de seleção também não são completamente considerados nesta metodologia de análise. Se as subpopulações estão sob diferentes pressões seletivas, a seleção poderá ter efeitos muito diferentes sobre os alelos e sobre as combinações genotípicas.
Por outro lado, conforme destaca Excoffier et al.(1992), o propósito principal da AMOVA é delinear a extensão da diferenciação genética entre e dentro de populações, através de componentes de variância. Por isso, os resultados obtidos deverão ser interpretados com a devida cautela.