4. METOD
4.2. Atıksu Numunelerinin Antibiyotik Kalıntıları Açısından Karakterizasyonu
Malkara, Kırklareli, Karpuzlu, Lüleburgaz Evsel AAT ile Çorlu Deri Karma OSB ve Çerkezköy OSB Endüstriyel AAT’nin ham giriş atıksuları ile biyolojik arıtılmış çıkış sularının içindeki antibiyotik kalıntılarının türleri ve miktarlarına dair karakterizasyonu Shimadzu Prominence Modular LC20A Marka HPLC/MS-MS cihazında yürütülmüştür (Resim 4.2.1 ).
Resim 4.2.1. İncelenen evsel ve endüstriyel atıksu numunelerinin antibiyotik karakterizasyonunun yapıldığı HPLC/MS-MS cihazı
45
Antibiyotik karakterizasyonu için yürütülen HPLC/MS-MS ölçümlerinde atıksular içindeki antibiyotik kalıntılarının zenginleştirilmesi için Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) metodu kullanılmıştır.
4.2.1. Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE) ve Geri Kazanım
Evsel ve endüstriyel atıksu arıtma tesislerinin ham giriş ve konvansiyonel yöntemlerle biyolojik olarak arıtılmış çıkış sularından alınan atıksu numunelerinin içindeki antibiyotik kalıntı miktarlarının ölçülebilmesi için öncelikle, atıksu nunumesi içinde antibiyotik kalıntılarının zenginleştirilmeleri gerekmektedir. Zenginleştirme işlemi için “Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) Metodu” uygulanmıştır. Bunun için, laboratuvar ortamında farklı pH ve kartuşların kullanıldığı metodlar denenmiş ve çalışılan gerçek evsel ve endüstriyel atıksulardaki antibiyotik kalıntılarında en yüksek geri kazanımın gereçekleştirildiği SPE metodu belirlenmiştir (Resim 4.2.2).
En yüksek geri kazanımın gerçekleştirildiği SPE metoduna göre; alınan tüm evsel ve endüstriyel atıksu numuneleri, literatürde belirtilen EPA-1694 Metodu’na göre hazırlanmış olup önce 1,2 µm, daha sonra 0,45 µ µm filtre kağıdı (Millipore, MA, USA) yardımıyla vakum filtrasyona tabi tutulmuştur.
Resim 4.2.2. SPE için hazırlık yapılması
Sonrasında, evsel ve endüstriyel atıksu numuneleri, HCl ile asitlendirilerek pH 2.0 ve pH 5.0’a ayarlanmıştır. İçerdiği antibiyotik kalıntılarının metal iyonlarıyla kompleks oluşturabilme ihtimalini önlemek için 100 mg Na4EDTA.2H2O ilave edilip 1-2 saat boyunca ara ara çalkalayıcıda dengelenmeye bırakılmıştır.
46
Denenen farklı tipte sorbentler içeren ve hidrofilik/lipofilik kapasitesinde kartuşlar arasında en yüksek geri kazanımın elde edildiği kartuş olarak hidrofilik/lipofilik kapastesi 60mg/3ml olan Oasis marka HLB cartridges (Waters, Millford, MA, USA) seçilmiştir. Her bir evsel ve endüstriyel atıksu numunesi için ayrı ayrı kullanılan kartuşlar önce 20 mL Metanol (MeOH), sonra 6 mL ASTM D1193-99 standartlarında ultra saflıkta suda (high grade reagent water) şartlandırılmıştır. Kartuşların şartlandırılması işleminin tamamlanması için pH 2.0± 0.5’de 6 mL ultra saflıkta su ile elute edilmiştir. Her biri 220 mL hacmindeki evsel ve endüstriyel atıksu nununeleri, 0,5 ml/dk hızla Supelco Markalı vakumlu manifold yardımıyla şartlandırması tamamlanmış kartuşlardan geçirilmiştir (Resim 4.2.3).
Resim 4.2 3. Vakumlu Manifold ile şartlandırılmış kartuşlarla filtrasyon
Evsel ve endüstriyel atıksu numuneleri içindeki antibiyotik kalıntı miktarının zenginleştirilmesi için, şartlandırılmış kartuşlardan geçirme işlemi tamamlanmasının hemen ardından her bir kartuş vakum cihazında 1 saat boyunca kurumaya bırakılmıştır. Kuruyan kartuşların 10 ml MeOH ile elut edilerek sorbentlerinde biriken antibiyotikleri geri kazanılıp ayrı bir tüp içinde toplanmıştır. MeOH çözeltisindeki ekstraktın konsantre edilmesi için 50o
C N2 gazı altında (oksidasyonu önlemek için) kurumaya bırakılarak sıvı kısmın tamamen uçurulması sağlanmıştır (Resim 4.2.4).
47
Resim 4.2.4. Azot altında uçurma ve ekstrakte edilen eluantlar
Sonrasında 750 µL Metanol (MeOH) ve 250 µl saf suda hazırlanan %0,1’lik Formik Asit (FA) çözeltisi ile tamamlandıktan sonra 2 dakika boyunca vorteks cihazında karıştırılarak içindeki reaktiflerin homojen dağılımı sağlanmıştır.
0,22 µm şırınga filtreden geçirilen antibiyotik kalıntıları geri kazanılmış ekstrakt, Supelco markalı 100 mm uzunluğunda 2,7 micron çapında C8 kolonun bağlandığı HPLC/MS-MS cihazına enjekte edilmek üzere 1 mL ‘lik amber vial tüplere alınmıştır (Şekil 4.2.5).
Resim 4.2.5. Filtrasyon ve sonrası vial tüplere konulan numuneler
USP (United States Pharmacopeia) firmasından temin edilen her bir antibiyotiğe ait referans standart >%95 saflıktadır. Tüm standart stok çözeltileri, EPA-1694 Metodu’na göre hazırlanıp muhafaza edilmiştir. ERY ve SMX antibiyotiklerine ait standart stok çözeltileri MeOH’de, CIP antibiyotiği standart stok çözeltisi ise yüksek saflıkta su ile hazırlanmış olup amber cam kaplarda -20oC de karanlıkta saklanmıştır.
Analiz çalışması esnasında kullanılacak standart stok çözeltileri 1000 mg/L konsantrasyonunda hazırlanmış olup günlük olarak çalışma yapılmadan hemen önce 200
48
mg/L’ye seyreltilmiştir. Aradığımız antibiyotik moleküllerinin öncü (precursor) (Q1) ve ürün (product) (Q3) iyonlarını tespit etmek için kütle dedektörüne infüzyon (enjekte) edilmiştir. Daha sonra molekülleri kolondan geçirip pikleri görebilmek için her bir molekülün100 ppb konsantrasyonunda olduğu karışım çözelti kullanılmıştır. Stok çözeltiler +4oC ‘de karanlıkta muhafaza edilmiştir.
Evsel ve endüstriyel atıksu numunelerindeki antibiyotiklerin karakterizasyonuna dair kromatografik analizler, üçlü kuadropol kütle spektrometresi (AB Sciex 3200 QTRAP triple quadrupole mass spectrometer, QQQ/MS-MS, Canada marka) ile kombine edilmiş HPLC/MS-MS (Shimadzu Prominence Modular LC20A HPLC marka) cihazında yürütülmüştür (Resim 3.2.1).
Supelco marka ve 100 mm uzunluğunda 2,7 micron çapında C8 dolgulu kolonun şartlandırılması için, öncesinde %40 Aseto Nitril (ACN) - %0,2 Formik Asit (FA) ve %40 Aseto Nitril (AC) - %40 Metanol (MeOH) - %5IPA - %15 su ile yıkanmıştır. HPLC/MS-MS ile analiz esnasında Mobil faz (A) olarak suda 5 mM amonyum format ve Mobil Faz (B) olarak ACN de %0,1 FA kullanılmıştır.
Kolonun şartlandırılması, önce 1 dakika, daha sonra 5 dakika boyunca 0,30 mL/dk %98 mobil (A) fazı ve %2 mobil (B) fazı geçirilerek, ardından 2 dakika daha sonra 1 dakika boyunca 0,30 mL/dk %1 mobil (A) fazı ve %99 mobil (B) fazı geçirilerek, en son olarak da 1 dakika boyunca 0,30 mL/dk %98 mobil (A) fazı ve %2 mobil (B) fazı geçirilerek tamamlanmıştır. Analiz şartları olarak, kolon fırını sıcaklığı 45oC, optimum akış hızı 0.3 mL/dk’dır. ESI/MS-MS parametrelerinde iyon kaynağı sıcaklığı 500oC, perde (curtain) gaz ve çarpışma (collision) gazı olarak basıncı 30 psI olan azot gazı kullanılmış olup, cihaza numune enjeksiyon hacmi ise 20 µL olacak şekilde düzenlenmiştir.