Arazi çalışmaları ve agronomik ölçümler

Varyasyon kaynağı oluşturulduktan sonra, biçimden hemen önce bitkilerin toprak yüzeyinden en uç noktasına kadar olan yüksekliği ölçülerek bitki boyu cm cinsinden belirlenmiştir. Yine biçim öncesi 200 bitkinin yapraklarının klorofil içeriklerinin renk yoğunluğu değerleri tespit edilmiştir (her bitkiden 10 yaprak). SPAD- 502, Osaka, Japan klorofil metre aleti kullanılmıştır.

Çiçeklenmenin hemen öncesinde seçilen 200 adet bitki biçim yüksekliği yerden 10 cm olacak şekilde hasat edilerek Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Laboratuvarları’na götürülmüştür. Her bitkiden ayrılan dört adet yaprak örneğinde yaprak alanı ve yaprak çevresi ölçümleri yapılmış, dijital kumpasla yaprak kalınlığı ölçülmüştür. Hasat sonrasında bitkiler tartılarak bitki başına yeşil herba miktarı bulunmuştur. Ardından yaprak ve sapları birbirinden ayrılarak, bitki başına yaprak, sap ve yaprak/sap oranları belirlenmiştir. Yapraklar kurutma dolabında 37 °C’ de 7-10 gün süreyle kurutulduktan sonra bitki başına kuru yaprak miktarları tespit edilmiştir. Kurutulan yapraklar içerik analizleri yapılmak üzere muhafaza edilmiştir. Denemenin birinci yılında arazide yürütülen çalışmalar Şekil 3.6’ da gösterilmiştir.

34

3.4.3.2. Denemenin ikinci yılında yapılan çalışmalar 3.4.3.2.1. A klonlarının seleksiyonu

Hasat öncesi ve sonrasında elde edilen veriler yaprak kalınlığı (mm), bitki boyu (cm), yaprak alanı (mm²), yaprak çevresi (mm), klorofil, bitki başına yeşil herba miktarı (g), bitki başına yeşil yaprak miktarı (g), bitki başına yeşil sap miktarı (g) ile steviosid, rebaudiosid A oranları değerlendirilmiştir. Elde edilen verilere göre seleksiyon kriteri olarak; yüksek glikozit oranı, yüksek reb A/stv, yalnız stv içeren, dengeli reb A/ stv,

yüksek stv oranı ve yüksek reb A oranı belirlenmiştir. Buna uygun olarak 40 bitki A- klonu olarak seçilmiştir.

3.4.3.2.2. Varyasyon kaynağından alınan çeliklerden fide elde edilmesi ve fidelerin araziye aktarılması

Seleksiyonu yapılan bitkilerin her birinden, Mayıs 2015’te 15 adet olacak şekilde yaklaşık 6-8 cm boyunda çelikler alınarak, etiketli ıslak bezlere sarılmıştır. Islak bez ile sarılmış olan bitkiler taşınabilir saklama kabına alınarak, köklendirilmek üzere, hızlı bir şekilde Grow Fide’ye götürülmüştür. 6-8 cm boyundaki çelikler, Grow Fide’ ye ait sisleme serasında, torf+perlit (1:1) hacimsel ortamına aktarılmadan önce her defasında steril edilmiş makaslarla temizlenerek 216’ lık viollere her violde 5 bitkiden en az 15 çelik olacak şekilde dikilmiştir. Her bir çeliğin sap kısmı dikimden önce 10 saniye kadar 500 ppm indol bütirik asit (IBA) içerisinde bekletilmiştir. Ardından kontrollü koşulların olduğu sisleme seralarına köklendirilmek üzere alınmıştır. Sisleme sistemi otomatik olup, ilk birkaç gün 2 dakika aralıkla daha sonra 10 dakika aralıkla çalışmıştır.

Çizelge 3.3. A klonlarının çelik ve fide sayıları

KLON NO

ÇELİK ADEDİ FİDE ADEDİ KLON

NO

ÇELİK ADEDİ FİDE ADEDİ 1 16 16 93 18 18 4 31 31 96 32 32 7 10 10 98 16 16 14 22 22 100 27 27 15 41 0 105 23 23 16 24 24 109 24 24 Devamı arkada

35 Çizelge 3.3’ ün devamı. 31 17 17 110 25 25 44 31 31 111 29 29 51 31 31 116 21 21 52 24 24 119 16 16 54 18 18 129 28 28 56 30 30 133 22 22 66 24 24 141 23 23 71 41 41 152 31 31 72 23 23 159 28 28 78 30 30 161 24 24 82 30 30 185 36 36 83 22 22 191 26 26 84 34 34 196 25 25 88 17 17 202 29 29

Seçilen bitkilerden alınan çelikler (yaklaşık olarak 800 adet çelik) Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Deneme Arazisi’ne getirilmeden önce, arazi dikim için hazırlanmıştır. Toprak hazırlığı yapılmış, damlama sulama sistemi kurulmuş, sıralar açılarak bitkilerin etiketleri araziye çakılmıştır. Seçilen bitkilerden alınan çelikler (yaklaşık olarak 800 adet çelik) Grow fidede 21 günde 40 genotipi temsil eden çelikler köklendirildikten sonra araziye aktarılmıştır. Dikimde sıra arası mesafe 60 cm, sıra üzeri mesafe 40 cm olacak şekilde, 15-20 cm derinliğinde açılan ocaklara dikim yapılmıştır. Dikimden hemen sonra can suyu verilmiştir. 40 bitkiye ait 10 klon deneme arazisine yine bu 40 bitkiye ait her bitki için 8 adet klonda oluşabilecek bir olumsuzlukta kullanılmak üzere çalışmanın yedeği olarak araziye dikilmiştir. 40 genotipten alınan çelik sayıları ve fide oluşum sayısı Çizelge 3.3’te gösterilmektedir. 40 genotipten alınan çelik sayısı kadar fide oluşmuş, fide elde yüzdesi %100 olmuştur.

3.4.3.2.3. A klonlarında uygulanan kültürel işlemler

Dikimden önce deneme alanı derin bir şekilde sürdürülmüş ve üzerine diskaro geçirilerek keseklerin kırılmasıyla düzgün bir alan oluşturulmuştur. Deneme alanına damlama sulama sistemi, damlama boruları her bir bitkinin yanından geçecek şekilde döşenmiştir. Yüksek sıcaklıkların olduğu dönemlerde su ihtiyacı fazla olduğundan

36

günde yaklaşık olarak 8-10 saat süreyle, nem miktarının % 60 üzerinde olduğu Antalya koşullarında günde yaklaşık olarak 4-5 saat sulama yeterli olmuştur. Bitkilerin gelişme ve büyüme gösterdiği dönem boyunca yabancı ot kontrolü el ile sökülerek uzaklaştırmak suretiyle gerçekleştirilmiştir. Deneme süresince bitkilerde herhangi bir hastalık ve zararlı etmenine rastlanmamıştır.

3.4.3.2.4. Hasat öncesi yapılan çalışmalar ve hasat

A-klonlarında biçimden hemen önce bitkilerin toprak yüzeyinden en uç noktasına kadar olan yüksekliği ölçülerek bitki boyu cm cinsinden belirlenmiştir. Biçim öncesi sıralardaki bitkilerin yapraklarının klorofil içeriklerinin renk yoğunluğu SPAD- 502, Osaka, Japan klorofil metre aleti ile tespit edilmiştir (her bitkiden 10 yaprak). Taşınabilir klorofil metre cihazı klorofili dolaylı olarak ölçer ve değerler 1 ile 100 arasında olup, birimsizdir.

Sıralardaki bitkilerin hasadı çiçeklenmenin hemen öncesinde Antalya koşullarında Eylül ayının ikinci haftası gerçekleştirilmiştir. Sıralardan bitki biçim yüksekliği yerden 10 cm olacak şekilde hasat edilen bitkiler Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Laboratuvarları’na götürülmüştür.

A klonlarının yaprak kalınlığı (mm), yaprak alanı (mm²), yaprak çevresi (mm), bitki başına yeşil herba miktarı, bitki başına yeşil yaprak miktarı, bitki başına yeşil sap miktarı ve bitki başına yaprak / sap oranları belirlendikten sonra yapraklar oda sıcaklığında (37 °C) 7-10 gün süreyle kurutulduktan sonra bitki başına kuru yaprak miktarları tespit edilmiştir. Daha sonra kurutulan yapraklar içerik analizleri yapılmak üzere muhafaza edilmiştir. Şekil 3.7’de denemenin ikinci yılında arazide yürütülen çalışmalar gösterilmektedir.

37

3.2.3.3. Denemenin üçüncü yılında yapılan çalışmalar 3.2.3.3.1. B klonlarının seleksiyonu

Hasat öncesi ve sonrasında elde edilen veriler (yaprak kalınlığı (mm), bitki boyu (cm), yaprak alanı (mm²), yaprak çevresi (mm), klorofil, bitki başına yeşil herba miktarı, bitki başına yeşil yaprak miktarı, bitki başına yeşil sap miktarı) ile steviosid, rebaudiosid A oranları değerlendirilmiştir. Elde edilen verilere göre seleksiyon kriteri olarak; yüksek glikozit oranı, yüksek rebaudioside A miktarı, yalnız steviosid içermesi ve rebaudiosid A / steviosid oranının yüksek olması belirlenmiştir. Buna uygun olarak 10 bitki B-klonu olarak seçilmiştir.

3.2.3.3.2. A klonlarından fide elde edilmesi ve araziye aktarılması

Seleksiyonu yapılan bitkilerin herbirinden en az 40 adet olacak şekilde yaklaşık 6- 8 cm boyunda çelikler alınarak, etiketli ıslak bezlere sarılmıştır. Islak bez ile sarılmış olan bitkiler taşınabilir saklama kabına alınarak, köklendirilmek üzere, hızlı bir şekilde Grow Fide’ye götürülmüştür. 6-8 cm boyundaki çelikler, Grow Fide’ ye ait sisleme serasında, torf+perlit (1:1) hacimsel ortamına aktarılmadan önce her defasında steril edilmiş makaslarla temizlenerek 216’ lık viollere her violde 10 bitkiden en az 40 çelik olacak şekilde dikilmiştir. Her bir çeliğin sap kısmı dikimden önce 10 saniye kadar 500 ppm indol bütirik asit (IBA) içerisinde bekletilmiştir. Ardından kontrollü koşulların olduğu sisleme seralarına köklendirilmek üzere alınmıştır. Stevia bitkisi nemi sevdiği için, sisleme sistemi dikimden sonra ilk 5 gün boyunca 5 dakikada 1 defa 10 saniye süre ile, daha sonraki günlerde 10 dakikada 1 defa olacak şekilde çalıştırılmıştır. Sisleme sisteminin üzerine gölgelendirmek amacıyla yeşil örtü serilmiştir. B klonlarının çelik ve fide sayıları Çizelge 3.4’ te gösterilmektedir.

Çizelge 3.4. B klonlarının çelik ve fide sayıları

KLON NO ÇELİK ADEDİ FİDE ADEDİ

82 50 30 83 54 30 100 88 30 109 64 30 111 85 30 116 41 30 133 58 30 185 46 30 191 78 30 196 73 30

B klonlarını temsil eden fideler Grow fidede köklendirildikten sonra (yaklaşık olarak 4 hafta) Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Deneme Arazisi’ne dikim için getirilmiştir. Fideler uygulama alanına getirilmeden önce, arazi dikim için hazırlanmıştır. Toprak hazırlığı yapılmış, damlama sulama sistemi kurulmuş,

38

sıralar açılarak bitkilerin etiketleri araziye çakılmıştır. Her bir klon için 10 bitki sıra parsellere aktarılmış, bir parselde 1 klondan 10 bitki olacak şekilde, bir tekerrürde 10 parsel 100 bitki olacak şekilde deneme üç tekerrürlü olarak tesadüf blokları deneme desenine uygun şekilde oluşturulmuştur. Dikimde sıra arası mesafe 60 cm, sıra üzeri mesafe 40 cm olacak şekilde, 15-20 cm derinliğinde açılan ocaklara dikim yapılmıştır. Dikimden hemen sonra can suyu verilmiştir.

3.2.3.3.3. B klonlarında uygulanan kültürel işlemler

Dikimden önce deneme alanı derin bir şekilde sürdürülmüş ve üzerine diskaro geçirilerek keseklerin kırılmasıyla düzgün bir alan oluşturulmuştur. Deneme alanına damlama sulama sistemi, damlama boruları her bir bitkinin yanından geçecek şekilde döşenmiştir. Yüksek sıcaklıkların olduğu dönemlerde su ihtiyacı fazla olduğundan günde yaklaşık olarak 8-10 saat süreyle, nem miktarının % 60 üzerinde olduğu Antalya koşullarında günde yaklaşık olarak 4-5 saat sulama yeterli olmuştur. Bitkilerin gelişme ve büyüme gösterdiği dönem boyunca yabancı ot kontrolü el ile sökülerek uzaklaştırmak suretiyle gerçekleştirilmiştir. Deneme süresince bitkilerde herhangi bir hastalık ve zararlı etmenine rastlanmamıştır.

3.2.3.3.4. Hasat öncesi yapılan çalışmalar ve hasat

B klonlarında biçimden hemen önce bitkilerin toprak yüzeyinden en uç noktasına kadar olan yüksekliği ölçülerek bitki boyu cm cinsinden belirlenmiştir. Biçim öncesi sıralardaki bitkilerin SPAD-502, Osaka, Japan klorofil metre aleti kullanılarak yapraklarının klorofil içeriklerinin renk yoğunluğu değerleri tespit edilmiştir (her bitkiden 10 yaprak). Taşınabilir klorofil metre cihazı klorofili dolaylı olarak ölçer ve değerler 1 ile 100 arasında olup, birimsizdir.

Parsellerdeki bitkilerin hasadı çiçeklenmenin hemen öncesinde Antalya koşullarında Eylül ayının ikinci haftası gerçekleştirilmiştir. Parsellerden bitki biçim yüksekliği yerden 10 cm olacak şekilde hasat edilen bitkiler Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü Laboratuvarları’na götürülmüştür.

3.4.4. Analiz metodları ve in vitro çoğaltım çalışmaları