Apoptotik Đndeks

Apoptotik indeks, TUNEL metodunda, kesitler protokole uygun olarak boyandı. (Apoptotik indeks: Apoptotik hücre / Total hücre). Apoptotik indeksin, incebarsağın epitel ve kas dokularının her ikisi için de radyoterapi grubunda kontrol grubuna göre belirgin olarak arttığı gözlendi (sırasıyla p<0.001 ve p=0.006). Erdostein + radyoterapi grubunda ise radyoterapi grubuna göre belirgin bir azalma tespit edildi (her iki doku için; p<0,001). Erdostein ve radyoterapi grubunda indeks, kontrol grubuyla benzerdi.(p>0.05) (Şekil 3.2.4’de gruplardaki immünhistokimyasal boyama örnekleri gösterilmiştir. Grafik 3.2.7 ve Grafik 3.2.8’de sırasıyla epitel ve kas dokusundaki ekspresyonlar gösterilmiştir. Tablo 3.2.1’de epitel ve kas dokusundaki ortalama değerler verilmiştir)

Şekil 3.2.4: Đmmunohistokimyasal boyama; incebarsakta TUNEL boyama (X400). A: Kontrol grubu; epitel dokusunda çok az sayıda TUNEL-pozitif hücre görülmektedir (ok), kas dokusunda TUNEL-pozitif hücre izlenmemektedir. B: Radyoterapi grubu; bez epitelinde (a), villus epitelinde (b) ve kas dokusunda (c) TUNEL-pozitif hücrelerin arttığı görülmektedir (oklar). C: Erdostein grubu; az sayıda TUNEL-pozitif hücre görülmektedir (ok). D: Erdostein + radyoterapi grubu; TUNEL-pozitif hücre izlenmemektedir.

Grafik 3.2.7: Barsak epitelinde Apopitozis düzeyleri

Tablo 3.2.1:Barsak epitelinde ve kas tabakasında ortalama TGF-ß1, PCNA, 8-OHdG ve apopitozis düzeyleri

Kontrol RT Erdostein Erdostein+RT

TGF-ß1 Epitel Ortalama 1,63 1,30 1,88 1,80

TGF-ß1 Kas Ortalama 1,13 1,90 1,25 1,30

8-OHdG Epitel Ortalama 1,88 2,60 § 0,88 ++ 0,90 8-OHdG Kas Ortalama 2,38 2,40 §§ 0,63 ++ 0,90 PCNA Epitel Ortalama 15,59 14,85 17,69 + 22,93

PCNA Kas Ortalama 3,70 ** 18,71 6,77 14,06

Apopitozis Epitel Ortalama 1,55 **5,07 1,47 + + 0,68 Apopitozis Kas Ortalama 1,86 *5,22 1,89 ++ 0,57

* p=0.006 sadece RT grubu, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında,** p <0.001, sadece RT grubu, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, + p=0.018 sadece RT grubu ile karşılaştırıldığında ++ p <0.001, sadece RT grubu ile karşılaştırıldığında. (RT: Radyoterapi) § p=0.031 kontrol grubuyla karşılaştırıldığında §§ p<0.001 kontrol grubuyla karşılaştırıldığında

4.TARTIŞMA

Eksternal radyoterapi kanser tedavilerinde geniş yer alan ortak bir tedavi yöntemidir. Radyasyon etkilerine en hassas organ kemik iliği olmakla birlikte GĐS ikinci sırada gelmektedir. Gastrointestinal radyasyon hasarı iki ana nedenden dolayı önemli bir sorundur. Birincisi, morbiditeye bağlı önemli bir ekonomik yük (Sher 2010) ve hastaların yaşam kalitesinde önemli bir azalmaya neden olur (Bacon 2001, Bacon 2002). Đkinci olarak radyoterapide gastrointestinal normal doku tolerans dozu, kanseri kontrol etmek için kullanılan radyasyon dozunu sınırlar. Gastrointestinal radyasyon hasarının neden olduğu ishale bağlı akut sıvı ve elektrolit kayıpları giderilmezse hasta yaşamını tehdit edebilir (Slesinger ve Fordtran 1989). Bu geniş ve bazı durumlarda yaşamı tehdit eden veya radyoterapi uygulamasını en azından geciktiren veya mümkün kılmayan yan etkilerin değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu bağlamda radyoterapiye bağlı toksisite açısından teknik stratejileri kullanarak fiziksel olarak normal dokulardan radyasyon dozunu uzaklaştırmanın yanında, biyolojik stratejiler yoluyla iyonize radyasyonun hücresel ve doku yanıtınının düzenlenmesi büyük önem taşımaktadır.(Shadad ve ark 2013).

Histopatolojik incelemede antioksidan, anti-inflamatuar ve proliferatif etkileri olan erdostein ve radyoterapi verilen grupta; sadece radyoterapi uygulanan gruba göre hasar daha az gözlenmiştir ve istatiksel olarak anlamlıdır(p<0.001). Bu sonuç, erken fazda radyoterapi yan etkilerini azaltmakta kullanılan diğer ajanlarla benzer sonuçlar vermiştir. Erdostein + radyoterapi grubunda skor, kontrol grubuna göre yüksektir (p<0.001). Bu durum radyoterapinin hasar düzeyini azalttığı; fakat normal doku düzeyine getiremediğini göstermektedir.(Akpolat M ve ark 2009, Yoon ve ark 2011, Uzal C ve ark 2012)

Epitel ve kas dokusunda TGF-ß1 ekspresyonu açısından gruplar arasında anlamlı derecede fark görülmemesi erken fazda fibrozis belirteci olan TGF-ß1’in kullandığımız yöntemle gösterilemediğini düşündürmektedir. Martin ve ark.’ının TGF-ß1 ve fibrozis üzerine yaptığı derlemesinde, incelediği deneysel çalışmalarında ratların barsaklarına 5.2 Gy ile 9 fraksiyonda radyoterapi uygulanmıştır. 24.saat, 14.gün ve 26.haftada TGF-ß1’in ekspresyonunun arttığı immünhistokimya ile gösterilmiştir.(Martin M ve ark 2000) Bu derlemeyle beraber değerlendirildiğinde bizim çalışmamızda fark görülmemesi kullandığımız yöntemin yetersiz kaldığına bağlanabilir.

Đncebarsağın yüzey ve bez epitelinde ve kas tabakasında 8-OHdG ekspresyonunun kontrol ve radyoterapi grubu karşılaştırıldığında anlamlı bir fark gözlenmedi.(p>0.05). Erdostein ve erdostein+radyoterapi grubunda, radyoterapi grubuna göre anlamlı derecede azaldığı gözlendi (her ikisi için de p<0.001). Erdostein ve erdostein+radyoterapi grubu karşılaştırıldığında anlamlı bir fark gözlenmedi.(p>0.05).

Bu sonuç Toklu ve ark.’ının yaptığı nar kabuğu ekstresinin enterit ve lökosit apopitozisini engellediğini savunduğu deneysel hayvan çalışmasıyla karşılaştırıldığında kullandığımız metoda bağlı 8-OHdG ekspresyonunu gösteremediğimizi düşündürmektedir. Bu çalışmada ratlara 8 Gy tüm vücut radyoterapisinden 10 gün önce ve 10 gün sonra nar kabuğu ekstresi verilmiştir. Sonrasında da plazma ve ileum dokuları incelenmiştir. Plazmada 8-hidroksi-2'- deoksiguanosin (8-OHdG) (oksidatif DNA hasarı işareti) ELISA yöntemiyle belirlenmiş ve total antioksidan kapasiteye kalorimetrik test sistemiyle bakılmıştır. Radyasyona bağlı glutatyon ve total anti-oksidan kapasitesinin düştüğü, malondialdahid seviyelerinin, myeloperoksidaz aktivitesinin, 8-OHdG kontrol grubuna göre anlamlı derecede (p<0.001) arttığı bulunmuştur. Benzer olarak pro- inflamatur sitokinlerin (TNF-α, IL–1β ve IL–6) arttığı bulunmuştur. Nar kabuğu ekstresinin biyokimyasal değişiklikleri, lökosit apopitozisini ve hücre ölümünü azalttığı görülmüştür. Nar kabuğu ekstresinin barsak dokusundaki bu koruyucu etkileri reaktif oksijen metabolitlerinin azalması ve antioksidan mekanizmaların artışına bağlanmıştır. (Toklu ve ark 2009).Bu çalışmada savunulan oksidatif DNA işaretleyici 8-OHdG azalırsa, total antioksidan kapasite önemli ölçüde artar görüşüne göre; erdostein, 8-OHdG’yi azaltarak anti-oksidan kapasiteyi arttırmaktadır. Erdostein, kontrol ve sadece radyoterapi grubuyla karşılaştırıldığında 8-OHdG düzeyindeki yükselmeyi azaltır ve total antioksidan kapasitedeki azalma engellenmiş olur. Bu sonuç radyoterapinin mukozit yan etkilerinde erdosteinin antioksidan etkisiyle kullanılabilirliğini güçlendirmektedir.

Đncebarsağın yüzey ve bez epitelinde radyoterapi, kontrol grubuna göre anlamlı olmayacak düzeyde mitotik indeksi (PCNA) azaltmıştır. Erdostein + radyoterapi grubunda ise, radyoterapi grubuna göre artış izlendi (p=0.018). Kas dokusunda ise, radyoterapi grubunda kontrol grubuna göre mitotik indeksin belirgin olarak arttığı tespit edildi (p<0.001). Erdostein + radyoterapi grubunda ise radyoterapi grubuna göre bir azalma görüldü ancak fark istatistiksel olarak anlamlı

değildi (p>0.05) Bu sonuç Wang J ve ark.’ının yaptığı çalışmayla beraber değerlendirilirse, bu çalışmada da PCNA açısından anlamlı bir fark bulunamamıştı. Çalışmanın tartışmasında epitelde PCNA azalırsa, barsak dokusunun radyoterapiye bağlı duyarlılığı azalır ve mukozit yan etkisi daha az olur, ama çok azalması hasar iyileşmesini azaltır görüşü savunulmuştur.(Wang J ve ark 2001). Bizim sonuçlarımızda da erdostein yüzey epitelinde villüs proliferasyonunu arttırdığını ve doku sağlamlığını ve hasar iyileşmesini arttırdığı lehine yorumlanabilir

Apoptotik indeksin, incebarsağın epitel ve kas dokularının her ikisi için de radyoterapi grubunda kontrol grubuna göre belirgin olarak arttığı gözlendi (sırasıyla p<0.001 ve p=0.006). Erdostein + radyoterapi grubunda ise radyoterapi grubuna göre belirgin bir azalma tespit edildi (her iki doku için; p<0,001). Erdostein ve radyoterapi grubunda indeks, kontrol grubuyla benzerdi.(p>0.05). Bu sonuç radyoterapinin apoptotik indeksteki artışı, erdosteininin normal doku düzeyine getirerek; radyoterapinin apopitozis etkilerini azalttığını göstermektedir. Bu çalışmada dikkat çeken başka bir husus da radyoterapi grubunda kas tabakasının dış tabakasında apopitozis daha fazla gözlendiğiydi. Bu sonuç Ikeda ve ark.’ının intestinal iskemide apopitozise baktığı çalışmayla karşılaştırıldığında, kas tabakasının dış tabakasında damarlanma yapısı daha az olduğu için apopitozis daha fazla görülmesiyle uyumlu bulunmuştur.(Ikeda H ve ark 1998)

Başka benzer çalışmalara baktığımızda glutamin, radyasyona bağlı normal doku hasarının önlenmesinde birçok çalışmada kullanılmıştır. L- glutamin aminoasidi içerikli beslenme desteğinin radyoterapi uygulanmış ratlarda kolon duvarı mukozasında etkili olduğu görülmüştür (Diestel ve ark 2007). Aynı zamanda akciğer kanserli hastalarda glutamin desteğinin özofajiti koruyabileceği bulunmuştur (Topkan ve ark 2009). Rocha ve ark’ının yaptığı bir çalışmada radyasyona bağlı ratlarda oluşan mesane toksisitesinin engellenmesinde ve kollajen yoğunluğunun düzenlenmesinde glutamin incelenmiştir. Glutamin kullanımında ekstrasellüler matriks yüzdesinin daha düşük oranda azaldığı ama kas yüzdesindeki azalımı engelleyemediği bulunmuştur. (Rocha ve ark 2011).

Wang J ve ark.’ının yaptığı bir çalışmada somatostatin analogu octreotidin barsak radyoterapisi sonrası erken (2.haftada) ve geç fazda (26.haftada) koruyucu etkisine bakılmıştır. Bu çalışmada barsağın 4 cm’lik segmenti skrotal herni içine

yerleştirilmiş ve günlük 4.2 Gy dozla, hafta sonu ara verilmeksizin 16 gün fraksiyone radyoterapi uygulanmıştır. Radyoterapiden 2 gün önce başlanarak toplam 4 hafta boyunca 2 µg/kg/saat ve 10 µg/kg/saat deri altı pompalarla octreotid verilmiştir. Epitel ve düz kas hücresi çoğalması PCNA ile değerlendirilmiş, bağ doku mast hücresi hiperplazisine bakılmış, TGF- β1 ve kollajen düzeyleri değerlendirilmiştir. Oktreotid erken ve geç fazda doz bağımlı olarak doku hasarını engellediği bulunmuştur. Kronik fazda TGF- β, kollajen I ve kollajen III yükselişlerini azaltmıştır. Fakat oktreotidin TGF- β1 mRNA seviyelerini, mast hücre hiperplazisini ve düz kas hücre çoğalması(PCNA) üzerinde anlamlı bir fark bulunamamıştır.

(Wang J ve ark 2001)

Akpolat ve ark curcumin kullandığı hayvan çalışmasında 5 Gy sonrası dördüncü günde ileal hasarı görmüşlerdir. (Akpolat ve ark 2008) Korkut ve ark amifostinin kullanıldığı, histolojik karşılaştırmanın yapıldığı hayvan çalışmasında rektal proktit dozunun eşdeğerini 17,5 Gy olarak ve en iyi ikinci haftada değerlendirmiştir. (Northway ve ark 1988,Kan ve ark 2000, Korkut ve ark 2006). Sitokinler açısından da dokusal sitokinlerden IL–1β, IL–2, IL–6 ve IL–8 ‘in radyasyona bağlı rektal proktitte arttığı bulunmuştur. (Stein ve Hanauer 1999, Korkut ve ark 2006).

Caloğlu ve ark’ının yaptığı amifostin ve L-carnitin karşılaştırmasında 20 Gy pelvis radyoterapi sonrası 5.günde ince barsakta histolojik inceleme yapmışlardır. Çalışmanın sonucunda L-carnitin’in, amifostin kadar radyoterapinin yan etkisini azaltmada etkili olmadığı görülmüştür.(Caloglu ve ark 2012)

Dinçbaş ve ark’ının amifostin (S – 2 – 3 - Aminopropylamino ethylphosphorothioic acid) ve gemsitabin ile yaptığı 5x5 Gy/günlük fraksiyonun verildiği hayvan çalışmasında, idrar kesesi ve barsaklar dördüncü haftada incelenmiştir. Bu çalışmanın tartışmasında daha iyi fibrozis için uygun zamanın 20 - 24. haftada görülebileceği önerilmiştir. (Dincbas ve ark 2009)

Granulosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) ün kullanıldığı hayvan çalışmasında 12 Gy yarım tüm vücut radyoterapi sonrası 84.saatte barsak incelemesi yapılmıştır. (Kim ve ark 2012). Bu çalışmanın tartışmasında doza bağlı olarak yaşam süresinin kısaldığı tartışılmıştır. Örneğin bir hayvan çalışmasında 14,7 Gy (10% barsağa bağlı ölüm) ve 12 gün sonra ölüm (ortalama değer), 17.95 Gy (90% barsağa bağlı ölüm) 8 gün sonra ölüm görülmüştür.(Mason ve ark 1988; Rotolo ve ark 2009). Başka bir çalışmada 13,5 Gy ile tüm C3H/ HeN sıçanları mice gastrointestinal nedenle beşinci

günde ölürken, radyasyon etkisini azaltan bir ajan olan FGF-2 ile yaşam süresi %50 artarak 11 gün olmuştur.(Zhang ve ark 2010). Đlerleyen çalışmalarda C3H/HeN sıçanları 12 Gy ile pelvis ışınlaması sonrası 9.günde ölümler başlamış, %50’si 10.günde ölmüş ve 14.günde hepsi ölmüştür. G-CSF ile yapılan çalışmada hiçbir rat 10.günden önce ölmemiş ve %53’ü 14 gün yaşamıştır. (Kim ve ark 2012)

Triphala isimli Hindistan’da alternatif tıpta kullanılan bir ilaçla yapılan hayvan çalışmasında en uygun doz olarak 12.5 Gy doz brakiterapi ile 11.günde rektal mukoza incelenmiştir. (Yoon WS ve ark 2011)

Proteazla aktive olmuş reseptör -1 inhibitörünün kullanıldığı hayvan çalışmasında skrotal herni boşluğuna 4 cm’lik barsak segmenti konulmuş ve 5 Gy/günden 9 fraksiyon radyoterapi uygulanarak, ikinci haftada ince barsak dokusu incelenmiştir. (Wang ve ark 2013)

Erdostein 100 mg/kg dozda oral gavaj yoluyla uygulandığı hayvan çalışmasında geçici iskemi üzerine erdosteinin etkilerine bakılmıştır. Đskemi öncesi

gün başlanarak, deney bitimi olan sonraki 3 gün boyunca uygulandığı çalışmada,

intestinal iskemi ve reperfüzyonu sonucu oluşan malondialdehid (MDA), protein karbonil kontent (PCC) ve NOx seviyelerinin kontrol grubuna göre azalmış olduğu ve antioksidan enzim seviyelerinin, bizim çalışmamızla da uyumlu olarak, arttığı görülmüştür. Histolojik olarak da kontrol grubuna göre daha az hasar görülmüştür. MDA, reaktif nitrojen ve/veya reaktif oksijen sonucu oluşan lipid peroksidasyon son ürünüdür. PCC reaktif nitrojen ve/veya reaktif oksijenin proteinle karşılaşması

sonucu oluşur ve protein oksidasyonunu gösterir. (Tunc T ve ark 2009). Ratta

bacakta iskemi-reperfüzyon sonrası pankreas hasarının incelendiği başka bir çalışmada da 150 mg/kg erdostein 3 gün önceden ağız yoluyla verilmiş ve oksidatif stresin etkilerini ve histolojik hasarı azalttığı bulunmuştur. (Kockar MC ve ark 2012)

Sisplatinin oluşturduğu nefrotoksisite hasarı üzerine erdosteinin 10 mg/kg distile su ve NaHCO3 kullanılarak hazırlandığı, 1 gün öncesinde başlanarak sakrifiye

edilme günü olan 5 gün boyunca şırıngayla ağız yoluyla verildiği bir hayvan çalışmasında akut renal hasara neden olan glukoz metabolizması üzerine koruyucu etkileri olduğu bulunmuştur. (Yilmaz HR ve ark 2004). Benzer bir çalışmada da radyo kontrast maddenin testiste oksidatif stres üzerine, erdosteinin koruyuculuğunun araştırıldığı bir hayvan çalışmasında, erdosteinin 25 mg/kg distile su ve NaHCO3

kullanılarak hazırlanmıştır. 1 gün öncesinde başlanarak sakrifiye edilme günü olan 1. gün boyunca şırıngayla ağız yoluyla verilmiştir. Oksidasyon belirteci olan katalaz

enziminde ve histolojik incelemede sadece radyo kontrast madde enjeksiyonu yapılan grupla anlamlı bir farklılık bulunmamıştır. (Yilmaz HR ve ark 2008).

Radyoterapiye bağlı toksisitede patolojik değişimin erken inflamatuar fazın ardından geç stromal değişim olduğu gözlemlenmiştir. Bu yüzden erken zamanlı çalışmalarda geç oluşan fibrozis yerine, erken oluşan inflamasyon fazına bakılmıştır. (Rocha ve ark 2011).