Lipit oksidasyonu boyunca antioksidanlar metal iyon bağlayıcı, radikal giderici ve peroksit bozucu olarak çeşitli şekillerde hareket edeler ve sinerjiye neden olmalarından dolayı sıklıkla birden fazla mekanizma içerirler.
Kimyasal metotların çoğu farklı serbest radikalleri süpürme yeteneğine bağlıdır.(Che veAhn,1998).Serbest radikallerin gıdalarda doymamış yağların otooksidasyonuna neden olduğu iyi bilinir (Karve Perkins, 1991). Süperoksit radikali (O2-), hidroksit (OH), nitrik oksit (NO), alkil peroksit radikalleri, ABTS+ (2,2’-azobis 3-etil benzothiozoline-6-sülfonat), DPPH. (1,1-difenil-2-pikril hidrazin)radikali gibi farklı gidericilerle yapılan radikal giderim aktivite testleri geliştirilmiş ve gıda antioksidan çalışmaları ile ilgili reaktif oksijen türlerini belirleme metotları Aruoma ve grubu tarafından yeniden incelenmiştir (Aruoma vd., 1997).
Diğer yandan antioksidanları serbest radikal zincirini durdurduğuna ve fenolik hidroksil gruplarından hidrojen vererek kararlı bir son ürün oluşturarak ileri lipit yükseltgenmesinin başlamasını ve ilerlemesini engellediğine inanılır (Shewi 1978). Yükseltgenme belirlemelerinde katalizör olarak metal katyonları kullanılabilir (Chen ve Ahn, 1998, Ganthavorn ve Hughes, 1997).Demir ve bakır iyonları indükleyici olarak farklı sistemlerde yaygın olarak kullanılır (Chambers vd., 1996, Mùller vd., 1999, Ponginebbi vd., 1999). Antioksidan aktivite reaktif türlerinin üretilmesini sağlayan metalik katalizöre bağlıdır (Lapiotvd.,1999) ve bu metalik katalizörler varsayılan antioksidanı prooksidan olarak davranıp davranamayacağını beliler(Roeig-Penman ve Gordon, 1998). Fe3+ gibi yaygın metal iyonlarını antioksidanlar tarafından, antioksidan bir maddeyi prooksidant gibi davranmaya iten Fe2+ iyonlarına indirgeyebilir. Benzer etki diğer geçiş metalleri için de söylenebilir.
2.7.1 Toplam Antioksidan Aktivite Tayin Metodu (β- karoten- lineolik asit sistemi)
Bu metot linoleik asidin ısı ve hava oksidasyonuyla serbest radikal zincir reaksiyonu sonucu oluşan peroksitler tarafından β-karotenin renk açılımının izlenmesi temeline dayanır.(Wang ve ark.,2006)
Bu sistem linoleik asidin inkübasyonu sırasında oluşan peroksit ürünlerinin β- karotenin karakteristik sarı rengini tepkime vererek gidermesi ve bu renk gideriminin spektroskopik şekilde takip edilmesine bağlıdır (Eryiğit,2006). Reaksiyon sonunda çözeltide β-karotenin kaybolan sarı renginin absorbansı 470 nm’de spektrofotometrede ölçülür. Reaksiyon genellikle 50 oC başlar. Ortamda antioksidanların bulunması linoleik asitten oluşan peroksit ürünlerinin bu antioksidanlarla nötralize edilmesini sağlar ve sonucunda β-karotenin karakteristik sarı rengi korunmuş olur. Yani daha yüksek absorbans daha yüksek antioksidan aktiviteyi gösterir. Bu yöntemin üstünlüğü hızlı,basit ve duyarlı bir yöntem olmasıdır(Koleva ve ark.,2002)
2.7.2 Toplam Fenolik Madde Konsantrasyonu(Folin –Ciocalteu) metodu
Bitkilerde bulunan fenolik yapılı bileşikler antioksidan aktiviteye büyük oranda katkıda bulunurlar. Bu nedenle toplam antioksidan aktivite belirlemede,toplam fenolik madde miktarının bilinmesi önemlidir.Bir maddenin antioksidan gücü ihtiva ettiği fenolik maddelerin konsantrasyonuyla orantılıdır. Bu antioksidan kapasite tayin yöntemi,ortamda bulunan Mo(VI)’in ortama konan indirgeyici ajan tarafından Mo (V)’e indirgenmesi sonucu oluşan mavi-yeşil rengin spektrofotometrik olarak 765 nm’de ölçümü esasına dayanır (Öztürk ve ark.,2004).
2.7.3 Đndirgeme Gücü Kapasitesi (FRAP)Belirlenmesi metodu
Bu yöntemde, bir bileşiğin indirgeme gücü onun potansiyel antioksidan aktivitesinin bir göstergesidir.Bu yöntemde asıl belirlenen unsur,Fe+3iyonlarının ne oranda Fe+2 iyonlarına indirgendiğidir.
Fe (III)-L + antioksidan Fe(II)-L + Okside Antioksidan
Burada L, redoks reaksiyonu sonucu ortamı renklendiren Fe(II)-L üretebilen Ferro iyonu seçimli renklendiricili ligandı temsil etmektedir.
Bu yöntemde Fe+3-L kompleksi, asidik pH ortamında (pH=3,6) indirgen özellik gösteren antioksidan madde ile Fe+2-L kompleksine indirgenir. Fe+3-L kompleksi
şiddetli bir mavi renk verir. Oluşan bu kompleksin 700 nm’de absorbansı ölçülerek
elektron verici antioksidanların indirgeme gücü toplam olarak ölçülmektedir (Özyürek,2005).
Antioksidanların indirgeme gücüne bağlı olarak, sarı renkli çözeltinin renginin yeşil ile mavi arasında değişebilen tonlarda renk değişimi spektrofotometrik olarak ölçülür.
Bileşenlerin indirgeme kapasitesi o maddenin antioksidan gücünün bir göstergesi olabilir. Droglardaki antioksidan maddeler, indirgen özelliklerinden dolayı [Fe+3 /ferrisiyanat] kompleksine neden olurlar.Bu kompleksle oluşan Prusya mavisi renkli çözeltideki değişim 700 nm’de absorbansı ölçülerek gözlenmektedir (Gülçin,2006). 2.7.4 CUPRAC (Bakır(II) Đyonu Đndirgeme Antioksidan Aktivite Tayini)
Spektrofotometrik olarak bakır(II) ve neokuproin (2,9-dimetil -1,10-fenantrolin) reaktifi kullanılarak polifenolik bileşiklerin kapasitelerinin tayin edilmesi esasına dayanır. Bu metot Apak ve ark.(2007) tarafından indirgen özelliği olan protein, vitamin E, vitamin C ve sistein gibi biyolojik açıdan önemli bileşikler için geliştirilmiş bir metotdur.
Đyi bir indirgen olan polifenolik bileşikler, Cu(II)-Nc kompleksini, Cu(I)-Nc
kompleksine dönüştürür ve bu dönüşüm maksimum ışık soğurması gösterdiği 450 nm’de absorbansının ölçülmesi ile antioksidan kapasiteleri tayin edilir.
2n Cu(Nc)22+ +Ar (OH)n 2n Cu(Nc)2+ + AR(=O)n +2n H+
Elde edilen absorbans değerlerinden ekstrelerin antioksidan aktiviteleri TEAC (Troloksa eşdeğer antioksidan aktivite) cinsinden hesaplanır (Tütem ve Apak,1991;Tütem ve ark.,1997;Güçlü ve ark.,2005).
2.7.5 DPPH Radikal Süpürme Aktivitesi Tayin Metodu
DPPH yöntemiyle antioksidan aktivite, oda sıcaklığında metanol gibi organik çözücülerdeki sentetik radikallerin yakalanmasıyla değerlendirilir. DPPH (2,2- difenil 1-pikrilhidrazil) radikali taşıdığı tek elektron nedeniyle spektrofotometrede 517 nm’de kuvvetli absorpsiyon bandı verir. Bu tek elektron, ortamda bir serbest radikal yakalayıcısının varlığında çiftlenir Çiflenen elektron sayısı ile ilgili olarak oluşan spektrofotometrik renksizleşme sonucunda absorpsiyon kaybolur. Radikalin tek elektronunun çiftlenmesiyle meydana gelen bu DPPH absorbsiyonundaki renksizleşme, bileşiklerin herhangi bir enzimatik aktiviteye bağlı olmaksızın serbest radikal yakalama kapasitesini göstermektedir (Çalıkoğlu ve Bayrak, 2005).
Bu absorbans değerlerinden faydalanarak % Đnhibisyon değerleri ve IC50 değerleri hesaplanır. Numunelerin IC50 değerleri ne kadar düşük olursa , antioksidan aktivite etkisi de o kadar yüksek olur(Pourmorad,2006)
2.7.7 ABTS•+ giderme aktivitesi tayini
DPPH serbest radikal giderme aktivitesi gibi ABTS•+ giderme aktivitesi de sulu karışım ve içeceklerin ekstrelerin veya saf maddelerin radikal giderme aktivitelerinde sıklıkla kullanılmaktadır (Miller et al. 1996; Gülçin 2006b).
Bu metotta öncellikle ABTS radikali oluşturmak gerekmektedir. Burada oluşumu için geliştirilen teknik, ABTS ve potasyum persülfat arasındakireaksiyon sonucu mavi yeşil ABTS kromoforunun doğrudan oluşumu ve oluşan buradikal katyonun spektrofotometrik olarak ölçülmesini içerir. Bu metodun esasıoluşturulan ABTS•+ katyonik radikalinin 734 nm de maksimum absorbans göstermesi esasına dayanır. ABTS radikal katyonu farklı oksidan maddeler ile de hazırlanabilir. Oksidan olarak K2S2O8 kullanılabildiği gibi Mn2O3’de kullanılabilir. Potasyum persülfat veya Mn2O3 varlığında ABTS’den ABTS radikalleri (ABTS•+) meydana gelebilir. ABTS
radikalleri şu şekilde oluşmaktadır.
S2O82- +ABTS → SO42- +SO4
-.
+ ABTS+.
burda peroksidisülfatın yıkımı elektron transferinden sonra meydana gelebilir. Aşırı ABTS varlığında, sülfat radikali şu reaksiyona göre tepkime verir.
SO4 -•
+ 2ABTS → SO42- + + 2ABTS +.
net reaksiyon ise şöyle cereyan eder:
S2O82- + 2ABTS → 2SO42- + 2ABTS+.
ABTS radikalleri DPPH radikallerinden daha reaktifdirler ve bir H atom transferini gerektiren DPPH ile reaksiyonları farklıdır. ABTS radikalleri bir elektron transferini içerir (Kaviarasan et al. 2006).