Antioksidan Kapasite Testleri

4.2.1 Toplam Fenolik Madde Konsantrasyonu 4.2.1.1Materyal

Folin reaktifi (Sigma-Aldrich), Na2CO3, metanol, gallik asit (Merck), Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre.

4.2.1.2Metot

Toplam fenolik madde tayini Folin metoduna göre yapıldı. Standart olarak kullanılan gallik asit ve bitki ekstrelerinin çözeltileri hacimce %70’lik metanol içerisinde hazırlandı. Gallik asit kalibrasyon eğrisi için, gallik asidin (0,5-0,05 mg/ml) farklı konsantrasyonlarda %70 lik metanol çözeltileri hazırlandı. Bitki ekstrelerinin konsantrasyonu ise yine %70 lik metanolde 0,4 mg/ml olacak şekilde hazırlandı. Her bir deney tüpüne bitki ekstrelerinden 0,5 ml alındı. Üzerlerine 2,5

ml folin reaktifi (suda, %10 luk) ve 7,5 ml Na2CO3 (suda, %20 lik) ilave edildi ve kuvvetlice karıştırıldı. Oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat bekletildi. Bu süre sonunda 765 nm’de çözeltilerin absorbansları okundu. Aynı işlemler kalibrasyon eğrisi için hazırlanmış farklı konsantrasyonlardaki gallik asit çözeltilerine de uygulandı. Ekstre çözeltilerinin absorbansları, çizilen gallik asit kalibrasyon eğrisinden okunarak toplam fenolik madde konsantrasyonunu eşdeğer gallik asit olarak hesaplandı (mg/ml GAE) .

4.2.2 DPPH _{(1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil) Radikal Süpürme Etkisi} 4.2.2.1 Materyal

DPPH (Sigma-Aldrich) , BHA, BHT, metanol, (Merck), Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre.

4.2.2.2.Metot

Sanchez-Moreno (1998) metodu esas alınarak yapılmıştır. Liyofilize edilmiş droglarından ve sentetik antioksidan BHT ve BHA ile metanolde (0,4-0,05 mg/ml) beş farklı ekstre çözeltisi hazırlandı. DPPH’in kalibrasyon eğrisi için farklı konsantrasyonlarda (6.10-5-1,85.10-7 M), %70 lik metanol çözeltileri hazırlandı. Hazırlanan drog çözeltilerden 0,5 ml alınarak her birinin üzerine üzerine 3 ml DPPH çözeltisi (6.10-5 M) ilave edildi. Kuvvetlice karıştırılıp ağzı kapatıldıktan sonra 30 dakika süre ile karanlıkta bekletildi. Bu sürenin sonunda her bir karışımın absorbansları spektrofotometrede 517 nm’de okundu. Her bir bitkinin ayrı ayrı % inhibisyon değerleri hesaplandı;

I (%) = (A0 - Anumune / A0) x 100

Bu değerlerden ve DPPH’in kalibrasyon eğrisinden faydalanarak her bir bitki için DPPH serbest radikalinin yarısının süpürüldüğü andaki bitki ekstresi konsantrasyonu (IC50) değerleri hesaplandı. Değerler sentetik antioksidan olan BHT ve BHA ile kıyaslandı.

4.2.3 CUPRAC Metodu ile Antioksidan Aktivite Tayini 4.2.3.1.Materyal

Neocuproine (2,9-dimethil-1,10-fenantrolin), BHT, BHA, Troloks, (Sigma- Aldrich), CuCl2.2H2O, metanol, etanol, amonyum asetat (Merck), Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre.

4.2.3.2Metot

Çözeltilerinin Hazırlanması:

10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi;. CuCl2.2H2O’den 0,4262 g tartım alınıp su ile 250 mL’ye tamamlanarak hazırlandı.

Amonyum asetat çözeltisi; 1 M (pH=7). NH4Ac’dan 19,27 g tartım alınıp su ile 250 mL’ye tamamlanarak hazırlandı.

Neocuproine çözeltisi: 7,5x10-3 M Neokuproin (2,9 dimethyl 1-10 phenantroline)’den 0,039 g tartım alınıp %96’lık etil alkolle 25 mL’ye tamamlanarak hazırlandı.

Troloks çözeltisi: % 96’lık etanolde konsantrasyonu 1x10-3 M olacak şekilde hazırlandı.

Bu analiz Apak ve ark. (2006) yöntemine göre yapılmıştır. Đçerisine sırasıyla 1 mL 10-2 M CuCl2, 1 mL 7,5x10-3 M Neocproine çözeltisi ve 1 mL 1 M NH4Ac konulup çalkalanan tüplere, bitki ekstrelerinden (yüksek absorbans verdiğinde bitki ekstrelerinde gerekli seyreltme yapıldı) 0.5 mL eklenip üzerine toplam hacim 4.1 mL olacak şekilde 0.6 mL deiyonize su ilave edildi. Tüpler ağzı kapalı bir biçimde 30 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra 450 nm’de absorbans değerleri ölçüldü. Aşağıda verilen hesap yöntemiyle her bitkinin troloks eşdeğeri cinsinden kuru madde antioksidan kapasiteleri hesaplandı. Her bir bitkinin % nem oranları birbirinden farklı olduğu için kapasite değerlerinin hesaplanmasında % kuru madde değerleri göz önünde tutuldu.

Absorbans 4.1 100 100 1

TEAC(mmol/g)=  x  x  x  x 

4.2.4 β- Karoten- Lineolik Asit Emülsiyon Yöntemi 4.2.4.1Materyal

Kloroform (CHCI3), β- karoten, lineolik asit, tween 40 (Sigma-Aldrich), evaporatör, Shimadzu 1700 UV spektrofotometre

4.2.4.2 Metot

Đşlemler Amin ve Tan (2002)’ a göre yapıldı.

β- karoten- lineolik asit emülsiyon karışımının hazırlanması; 0,2 mg β- karoten, 1 ml kloroformda çözüldü. Üzerine % 60’lık 0,02 ml lineolik asit çözeltisi ve 200 mg Tween 40 ilave edildi. Kloroform vakum altında 40 oC de evaporatörde tamamen uzaklaştırıldı. 100 ml oksijenle doyuruldu ve deiyonize suda çözüldü.

Şiddetli şekilde karıştırıldı. Kontrol çözeltisi için aynı işlemler tekrarlandı. Ancak

sadece β- karoten ilave edilmedi.

Numunelerin ve karşılaştırılmak üzere hazırlanan sentetik antioksidan BHA ve BHT nin konsantrasyonu 1mg/ml olacak şekilde %70 lik metanolde hazırlandı. Deney tüplerine hazırlanan drog, BHA ve BHT çözeltilerinden 0,2’şer ml alınarak üzerlerine 5 ml hazırlanan emülsiyon çözeltisi ilave edildi. 40 oC de su banyosunda inkübasyona bırakıldı. Deney tüplerindeki numunelerin ve kontrol çözeltisinin absorbansı 470 nm de okundu (t0). Bu andan itibaren inkübasyondaki çözeltilerin absorbansı her 15 dakikada bir olmak üzere toplam 120 dakika boyunca okundu.

Bu absorbanslara dayanarak, yapılan hesaplamalarda absorbans değişim oranı (AO) ve buna bağlı olarak da % oksidasyonu engelleme katsayıları hesaplandı.

Absorbans değişimin oranı (AO) =

A0 = t0 anındaki absorbansı At = tanındaki absorbansı (t= 120 dk) % Oksidasyonu engelleme = x 100 ln ( A / A )_{0 t} t AO_(kontrol) AO _(numune)

4.2.5.Đndirgeme Gücü (FRAP Yöntemi) 4.2.5.1Materyal

FeCl3, metanol, fosfat tamponu, potasyum ferrosiyanad, trikloroasetik asit (TCA), BHA, BHT (Sigma-Aldrich), Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre, santrifüj.

4.2.5.2. Metot

Drogların indirgeme gücü Oyaizu (1986) metodu ile belirlendi. Drogların 5 farklı konsantrasyonda metanolik çözeltileri hazırlandı (0,4-0,04 mg/ml). Hazırlanan her bir çözeltiden deney tüplerine 2,5 ml numune alındı. Her birinin üzerine 200 mM 2,5 ml fosfat tamponu ve %1’lik potasyum ferrosiyonad çözeltisinden ilave edildi. Tüpler 45 oC’de 20 dakika boyunca su banyosunda inkübe edildi. Daha sonra 2,5 ml %10’luk trikloroasetik asit (TCA) ilave edilip, 10 dakika boyunca 600 rpm’de santrifüj edildi. Tüplerdeki karışımların üst kısmından 5’er ml alınarak başka tüplere aktarıldı. Yeni tüplere aktarılan numunelerin her birinin üzerine 5 ml deiyonize su eklendi. %0,1’lik FeCl3 ilave edildikten sonra oluşan yeşil renkli çözeltilerin absorbansları Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometrede 700 nm’de ölçüldü.

4.2.6 ABTS•+ giderme aktivitesi tayini

4.2.6.1 Materyal

0,1 M’lık fosfat tamponu, ABTS çözeltisi, potasyum persülfat çözeltisi, Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre, santrifüj.

4.2.6.2 Metod

Çözeltilerin Hazırlanması

1. 0,1 M’lık fosfat tamponunun hazırlanması (pH:7,4): 2,84 g Na2HPO4 180 ml destile suda çözündü. pH metre kullanılarak pH’sı 6,6’ya ayarlandı. Toplam hacim destilesu ile 200 ml’ye tamamlandı.

2. 2 mM’lık ABTS çözeltisinin hazırlanması: 11 mg ABTS 0,1 M’lık ve pH’sı 7,4 olan fosfat tamponunda tamamen çözününceye kadar bir gece boyunca karıştırıldı. 3. 2,45 mM’lık potasyum persülfat çözeltisinin hazırlanması: 66,25 mg K2O8S2 0,1 M’lık ve pH’sı 7,4 olan fosfat tamponunda tamamen çözününceye kadar manyetik karıştırıcı ile karıştırıldı. Toplam hacim destile su ile 100 ml’ye tamamlandı.

Kızılcık meyvesinde ABTS•+ giderme aktivitesi Re ve arkadaşlarının (1999) yaptığı çalışmaya göre belirlendi. Öncelikle 2mM’lık ABTS çözeltisi hazırlandı. Bu çözeltiye 2,45 mM’lık potasyum persülfat çözeltisi eklenerek ABTS•+ elde edildi. ABTS•+ çözeltisi kullanılmadan önce kontrol çözeltisinin 734 nm’de absorbansı 0,1 M ve pH’sı 7,4 olan fosfat tamponu ile 0,700±0,025 nm’ye ayarlandı. Farklı konsantrasyonlardaki meyan (Glycyrrhiza glabra 38L.) bitkisinin kök ve gövde kısımlarının su ve etanol ekstrelerinin stok çözeltisine 1 ml ABTS•+ çözeltisi ilave edildikten sonra 30 dakika inkübe edildi. Tampondan oluşan köre karşı 737 nm’de absorbansları kaydedildi.

4.2.7 Proantosiyanidin Konsantrasyonunun belirlenmesi 4.2.7.1 Materyal

Vanilin,kateşin, HCl , Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre.

4.2.7.2 Metot

Toplam proantosiyanidin konsantrasyonu Sun et al.(1998) prosedürüne göre belirlendi. Standart olarak kullanılan kateşin ve bitki ekstresinin çözeltileri hacimce %70’lik metanol içerisinde hazırlandı. Kateşin kalibrasyon eğrisi için, kateşinin (0,25-0,01 mg/ml) farklı konsantrasyonlarda %70 lik metanol çözeltileri hazırlandı. Bitki ekstrelerinin konsantrasyonu ise yine %70 lik metanolde 0,25 mg/ml olacak

şekilde hazırlandı. Her bir deney tüpüne bitki ekstrelerinden 0,5 ml alındı.

Üzerlerine 3ml %4 lük vanilin metanol çözeltisi ve 1,5 ml HCl ilave edildi ve kuvvetlice karıştırıldı. Oda sıcaklığında15 dk bekletildi. Bu süre sonunda 500nm’de çözeltilerin absorbansları okundu. Aynı işlemler kalibrasyon eğrisi için hazırlanmış farklı konsantrasyonlardaki kateşin çözeltilerine de uygulandı. Ekstre çözeltilerinin absorbansları, çizilen kateşin kalibrasyon eğrisinden okunarak toplam proantosiyanidin madde konsantrasyonunu eşdeğer kateşin olarak hesaplandı (mg/mlCE) .

4.3 HPLC ile Fenolik Madde Kompozisyonunun Belirlenmesi