KAN ANALİZİ

Çalışmaya katılan tüm olguların, antekubital brakial veninden 10 ml periferik kan örneği alındı. Materyal biyokimya tüpüne alınarak 5000 devirde 10 dakika kadar santrifüj edildi. Elde edilen süpernatan ependorflara alınarak -85ºC’de saklandı ve erime dondurma işlemi tekrarlanmadan bir seferde toplu olarak İL-17, İL-22, İL-23, DKK-1 ve sRANKL düzeyleri Hematoloji laboratuvar’ında laboratuvarında çalışıldı. Ayrıca çalışma kapsamında bulunan tüm olguların (PsA, psöriazis, sağlıklı kontrol) poliklinik kontrollerinde bakılan eş zamanlı ESR, CRP, hemogram sonuçları kayıt edildi.

Human İnterlökin-17A Enzyme-linked İmmunosorbent Assay Yöntemi

Human İL-17A kiti (Katalog No: BMS2017/BMS2017TEN) -85°C’de saklanan serum örneklerinde, Hematoloji laboratuvar’ında Biotek µ Quant (seri no:218731, USA) cihazında ELISA yöntemiyle çalışıldı.

Kitin bileşenleri:

1. Anti-human İL-17A antikorları ile kaplanmış plak (96 kuyucuk); 2. Biotinle- konjuge edilmiş anti-human İL-17A antikoru ; 3. Streptavidin peroksidaz ; 4. Standart ; 5. Numune dilüsyon tamponu; 6. Kit çözeltisi ; 7. Yıkama çözeltisi (20 kat konsantre); 8.

Substrat solüsyonu (tetrametil-benzidin); 9. Stop solüsyonu (1 M fosforik asit); 10. Mavi boya 0,4 ml; 11.Yeşil boya 0,4 ml; 12. Kırmızı boya 0,4 ml

Çalışma yöntemi: Antikor kaplı anti-human İL-17A , kuyucukların içine kondu.

Numune veya standartta bulunan human İL-17A daha önce kuyucukların içine yerleştirilen antikora bağlandı. Biotinle-konjuge edilmiş anti-human İL-17A antikoru eklendi ve ilk antikor tarafından hapsedilmiş human İL-17A’ya bağlandı (birinci inkübasyon). İnkübasyonu takiben, bağlanmayan biotinle-konjuge edilmiş anti-human İL-17A antikor yıkama aşamasında uzaklaştırıldı. Streptavidin peroksidaz (HRP) eklendi ve biotinle- konjuge edilmiş anti-human İL-17A antikora bağlandı (ikinci inkübasyon). İnkübasyonun ardından, bağlanmamış Streptavidin HRP enziminin uzaklaştırılması için yapılan yıkamadan sonra bağlı enzime etki eden bir substrat solüsyonu eklendi (üçüncü inkübasyon). Numune veya standartta bulunan human İL-17A miktarı ile orantılı olarak renkli reaksiyon ürünü elde edildi. Reaksiyon ortama stop solüsyonu (durdurucu solüsyon veya reaksiyonu durduran ayıraç da denebilir) eklenmesi ile sonlandırıldı. Bu solüsyonun, enzimi etkisiz hale getirebilmesi için kuyucukların içine hızlıca ve eşit oranda yayılmasına dikkat edildi ve sonuçlar hemen okundu. Her örneğin absorbansı spektrofotometre ile ölçüldü. Birincil dalga boyu 450 nm ve referans dalga boyu 620 nm (610-650 nm arasındaki değerler kabul edilebilir) olarak kabul edildi. Numune ve standartların absorbansları belirlendi. Dikey eksende ortalama absorbans, yatay eksende yer alan human İL-17A konsantrasyonu ile doğrusal standart eğri çizildi. Sonuçlar pg/ml cinsinden ifade edildi.

Human İnterlökin-22 Enzyme-linked İmmunosorbent Assay Yöntemi

Human İL-22 kiti (Katalog No: BMS2047/BMS2047EN) -85°C’de saklanan serum örneklerinde, Hematoloji laboratuvar’ında Biotek µ Quant (seri no:218731, USA) cihazında ELISA yöntemiyle çalışıldı. Çalışma prensipleri İL-17A ile benzerdi.

Human İnterlökin-23 Enzyme-linked İmmunosorbent Assay Yöntemi

Human İL-23 kiti (Katalog No: BMS2023/2-BMS2023/2TEN) -85°C’de saklanan serum örneklerinde, Hematoloji laboratuvar’ında Biotek µ Quant (seri no:218731, USA) cihazında ELISA yöntemiyle çalışıldı. Çalışma prensipleri İL-17A ile benzerdi.

33

Human Dickkopf-1 Enzyme-linked İmmunosorbent AssayYöntemi

RayBio Human DKK-1 kiti (Katalog No: ELH-DKK1-001) -85°C’de saklanan serum örneklerinde, Hematoloji laboratuvar’ında Biotek µ Quant (seri no:218731, USA) cihazında ELISA yöntemiyle aşağıda anlatıldığı biçimde çalışıldı.

Testin yapılışı:

1-Standart ve örneklerin hazırlanması: Kitte bulunan 300 ng/ml konsantrasyonundaki standart, standart dilüsyon tamponuyla dilue edildi. Dilüsyon sonrası standartlar seri dilüsyonlar yardımıyla 300ng/ml, 150ng/ml, 75ng/ml, 37,50ng/ml, 18,75ng/ml, 9,38ng/ml, 4,69g/ml ve 0 ng/ml konsantrasyona ayarlandı. -85°C’de saklanan plazma örnekleri oda ısısında çözündü. Çözündükten sonra herbir serum örneği standart dilüent tamponuyla dilüe edilip ELISAçalışma aşamalarına hazır hale getirildi.

2-Standart ve örneklerin ELISA kuyucuklarına konulması: Standart ve örnekler uygun şekilde dilüe edildikten sonra 96 kuyucuklu insana spesifik DKK-1 antikoruyla kaplı plağa konuldu. Her bir kuyuya 100µL plazma örneği ve 100µL standart pipetlenmiştir. Plağın yüzeyi kapatıldıktan sonra plak oda ısısnda 2,5 saat inkübe edildi.

3-Yıkama aşaması: 2,5 saatlik inkübasyon aşamasını takiben plağın yıkama aşamasınageçildi. Bu işlem, plaktaki sıvılar aspire edildikten sonra otomatize olarak her bir kuyucuğa verilen yıkama solüsyonu ile 4 kez tekrarlandı.

4-Biyotinlenmiş anti-human DKK-1 antikor eklenmesi: Daha sonra yine her bir kuyucuğa 100µL biyotinlenmiş anti-human DKK-1 antikoru (Biyotin ile konjuge) pipetlenmiş ve oda ısısında 1 saat inkübe edildi.

5-Yıkama aşaması: Yukarıdaki yıkama aşaması tekrarlandı.

6-Streptavidin-HRP solusyon ilavesi:Daha sonra her bir kuyucuğa 100µL Streptavidin-HRP solüsyonu konulmuştur ve 45 dakika oda ısısında inkübe edildi.

8-Kromojen ilavesi: Yıkama aşamasını takiben plağa 100µL tetrametilbenzidin substrat solüsyonu ilave edildi. 30 dakika oda ısısında plağın inkübasyonu yapıldı.

9-Reaksiyonun durdurulması: Plaklara 50µL2 M sülfirik asit içeren stop solüsyonu ilaveedilip reaksiyon durduruldu.

10-Plakların okunması: Plaklardaki optik yoğunluk (OD) 450nm dalga boyunda değerlendirildi.

11-Sonuçların hesaplanması: Dikey eksende ortalama absorbans, yatay eksende yer alan human DKK-1 konsantrasyonu ile doğrusal standart eğri çizildi. Sonuçlar ng/ml cinsinden ifade edildi.

Human “soluble” Reseptör Aktivatör Nükleer Faktör Kappa Beta Ligand Enzyme-linked İmmunosorbent Assay Yöntemi

Biovendor human sRANKL kiti (Katalog No:RD 1930042000R Lot No:RD2176 ) -85°C’de saklanan serum örneklerinde, Biotek µ Quant (seri no:218731, USA) cihazında Hematoloji laboratuvarında çalışıldı. Bu ölçümde kantitatif sandviç ELISA tekniği kullanıldı.

Testin prensibi: Standartlar, numunuler ve kontroller RANKL’a spesifik bir

antikorla kaplanmış mikrotabakaya yerleştirilir. Standardlar ve numunelerdeki RANKL, RANKL için spesifik olan immobilize antikor ve biotinlenmiş antikor tarafından sandviçlenir, bu da bir streptavidin-peroksidaz konjugatı tarafından tanımlanır. Tüm bağlanmamış materyal daha sonra yıkanarak ve uzaklaştırılır ve bir peroksidaz enzim substratı eklenir. Renk gelişimi durdurulur ve rengin yoğunluğu ölçülür. Ölçüm aşağıda anlatıldığı şekilde yapıldı:

1) Standartlar, numunuler ve kontrollerin 100 µL monoklonal anti-human sRANKL antikoru ile kaplanmış kuyucuklara yerleştirildi.

2) 2-8°C’de 16-20saat inkübe edildi.

3) Yıkama solüsyonu hazırlandıktan sonra 5 kez yıkandı. 4) Her kuyucuğa 100 μlt biotinlenmiş antikor eklendi.

35

5) Oda ısısında (25°C)1 saat inkübe edildi ve orbital mikrotabaka karıştırıcısında 300 devirde çevrildi.

6) 5 kez yıkandıktan sonra tabaka ters çevrildi ve içindekini kağıt bir havluya dökmek için sertçe vuruldu.

7) Her bir kuyucuğa 100μL Streptavidin-Peroksidaz konjugatı eklendi.

8) Oda ısısında (25°C)1 saat inkübe edildi ve orbital mikrotabaka karıştırıcısında 300 devirde çevrildi.

9) 5 kez yıkandıktan sonra tabaka ters çevrildi ve içindekini kağıt bir havluya dökmek içinsertçe vuruldu.

10) 100 μlt substrat solüsyonu tüm kuyucuklara eklendi. Mikrotabakanın günışığına maruz kalmaması için alüminyum folyo ile kaplandı.

11) 15 dakika oda ısısında inkübe edildi.

12) 100 μlt stop solüsyonu eklenerek renk değişimi durduruldu.

13) 450 nm dalga boyunda absorbanslar okundu.Absorbansların stop solüsyonu eklendikten sonraki 5 dakika içinde okunmasına özen gösterildi.

Sonuçların okunması: Standardın bilinen konsantrasyonu X eksenine, ona karşılık

gelen ortalama absorbans Y eksenine yerleştirilerek bir doğrusal eğri çizildi. Örneklerdeki sRANKL miktarı pmol/l olacak şekilde hesaplandı.