Hrc gen amplifikasyonu:

DNA fregmentleri agaroz jel elektroforez ile ayrılıp. ITM317 alttüründen gelen 593- bp’lik bir DNA fregmentinin amplifikasyonu için hrcC-2F (5’- GACCGGCTTGGTCAGGAAT-3’) VE hrcC-2R (5’-CGGCTTTTCCCGGATTTCT-3’) primerleri kullanıldı. PCR reaksiyon karışımındaki maddelerin final konsantrasyonları şu şekildedir. 1 mg/µl genomik DNA, 1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.5 uM primerler, 0.2 mM deoksinükleosit trifosfatlar (dNTP) ve 0.03 birim/µl Taq DNA

4 5 4 b p M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

polimeraz. PCR amplifikasyonları bir PCR makinesinde (Model PE 9700; Applied Biosystems, Foster City, CA) şu koşullarda uygulanmıştır: 94oC’de 5 dakika boyunca başlangıç denaturasyonu; 94oC’de 45 saniye, 55oC’de 1 dakika ve 72oC’de 2 dakika süren 30 döngü; 72oC’de 10 dakika süren tek bir final ekstensiyonu ile sonuçlanmıştır (Sisto, 2004) (Şekil 4.5.2.1)

Şekil 4.5.2.1. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Hrc primerleri kullanılarak yapılan PCR sonuçları

M,100 bp DNA leader söpss1,söpss6,çipss5,çipss6,napss4,napss8,kupss8,pss112referans kültür

5 9 3 b p M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Çizelge 7.1. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Bozdoğan ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

boPSS1 boPSS2 boPSS3 boPSS4 boPSS5 boPSS6 boPSS7 boPSS8 boPSS9 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + + + + -

hrc primeri + + + + + + + + + + + -

Çizelge 7.2. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Buharkent ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri

sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

buPSS1 buPSS2 buPSS3 buPSS4 buPSS5 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + -

hrc primeri + + + + + + + -

Çizelge 7.3. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Söke ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

söPSS1 söPSS2 söPSS3 söPSS4 söPSS5 söPSS6 söPSS7 söPSS8 söPSS9 söPSS10 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + + + + + -

hrc primeri + + + + + + + + + + + + -

Çizelge 7.4. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Çine ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

çiPSS1 çiPSS2 çiPSS3 çiPSS4 çiPSS5 çiPSS6 çiPSS7 çiPSS8 çiPSS9 çiPSS10 çiPSS11 çiPSS12 çiPSS13 çiPSS14 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + + + + + + + + + -

Çizelge 7.5. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Koçarlı ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

koPSS1 koPSS2 koPSS3 koPSS4 koPSS5 koPSS6 koPSS7 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + + -

hrc primeri + + + + + + + + + -

Çizelge 7.6. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Karacasu ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri

sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

kaPSS1 kaPSS2 kaPSS3 kaPSS4 kaPSS5 kaPSS6 kaPSS7 kaPSS8 kaPSS9 kaPSS10 kaPSS11 kaPSS12 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + + + + + + + -

Çizelge 7.6. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Karacasu ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri

sonuçlar (devamı)

Çizelge 7.7. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Nazilli ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

naPSS1 naPSS2 naPSS3 naPSS4 naPSS5 naPSS6 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + -

hrc primeri + + + + + + + + -

Çizelge 7.8. Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi Kuyucak ilçesi izolatlarının PCR’da kullanılan primerlere verdikleri

sonuçlar

Primerler

Đzolat numaraları

kuPSS1 kuPSS2 kuPSS3 kuPSS4 kuPSS5 kuPSS6 kuPSS7 kuPSS8 kuPSS9 kuPSS10 kuPSS11 kuPSS12 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + + + + + + + -

hrc primeri + + + + + + + + + + + + + + -

Primerler

Đzolat numaraları

kaPSS13 kaPSS14 kaPSS15 kaPSS16 kaPSS17 kaPSS18 kaPSS19 kaPSS20 kaPSS21 kaPSS22 PSS112 PSS116 P.s.pv.phaselicola

iaal primeri + + + + + + + + + + + + -

5.TARTIŞMA

Aydın ili ve ilçelerinde 2006 ve 2007 zeytin bahçelerinde yapılan surveyler sonucu il genelinde % 44,9, Kuyucak Đlçesinde % 80, Karacasu Đlçesinde % 69, Buharkent Đlçesi % 33, Nazilli % 20, Bozdoğan % 100, Koçarlı % 46, Söke % 10, Çine % 40 yaygınlık oranı belirlenmiştir. Karaca (1977) hastalığın en çok zarar verdiği bölgenin Ege olduğunu belirtmiştir. Çalışmamızda Aydın ilinde hastalığın daha çok Kuyucak ve Karacasu ilçelerinde

bulunduğu, tespit edilmiştir.

Literatür taramalarına göre Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi’nin Đspanya (Alonso ve ark., 1988), Fas (Benjama ve ark.,1993), Ürdün (Theabsim, 1991), Tunus (Boulila, 1994), ABD-kaliforniya (Teviotdale, 1994), Portekiz (Fermandes, 1994)’de mevcut olduğunu göstermiştir. Yunanistan da yapılan çalışmalarda Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi’nin zakkum (Nerium oleander) ve yasemin (Jasminum spp.)’de doğal enfeksiyonlara neden olduğu belirtilmiştir (Panagopolus,1993). Hastalığın ABD fidanlıklarında önemli kayıplara neden olduğu (Azad ve ark.,1995), Portekiz’de verim kayıplarına neden olduğu belirtilmektedir (Marcelo ve ark., 1999) 2003 yılında Avustralya’nın 10 km güneyinde yapılan bir çalışmada, öncelikle 2 yaşındaki zeytinliklerde Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi belirlenmiş ve bunu takip eden yıllarda 2 ile 5 yasındaki ağaçlarda da 4 farklı bitkide aynı simptomlar oluştuğu gözlenmiştir (Hall, 2004).

Türkiye’de 1939 yılında meydana gelen dolu yağışı sonucunda zeytin dal kanser hastalığının şiddetli bir şekilde görüldüğü Đyriboz’ca (1941) rapor edilmiştir. Karaca (1997)’de hastalığın Karadeniz, Marmara, Ege, Akdeniz, ve Güney Doğu Anadolu’da görüldüğü ancak Anadolu’nun Ege ve Akdeniz bölgelerinde daha şiddetli olduğunu bildirmişlerdir. Son yıllarda batı Akdeniz’in Antalya, Aksu, Döşemealtı, Serik, Manavgat, Kaş ve Kale ilçe ve köylerinde Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi’nin yaygınlığı belirlenmiştir (Basım ve ark., 2000; Ersoy,2002). Ege bölgesinin Aydın ve Muğla ili ve ilçelerinde’de yaygınlığı belirlenmiştir (Tatlı ve Benlioğlu, 2004)

Zeytin’ den bakteriyel patojenlerin izolasyonu için Azad ve Cooksey, (1995) zakkum izolatlatrından elde edilen P. s. pv. savastanoi izolatlarının teşhisi için "oleander knot agar" olarak adlandırdıkları OKA yarı seçici ortamını dizayn etmişlerdir. Tatlı ve Benlioğlu, (2004) yaptıkları izolasyon çalışmalarında urlu bölge ile sağlıklı ve hastalıklı bölgeden yaklaşık olarak 0.5–1 cm büyüklüğünde parçalar kesilerek %70'lik etil alkol ile 1–2 dakika arınık edilmiştir. Daha sonra steril damıtık su ile durulanmış ve steril kurutma kağıtları ile kurulanmıştır. Bu parçalar 1-2 mi steril damıtık su içinde havanda ezilmiş ve elde edilen süspansiyonlardan bir öze dolusu alınarak çizgi ekim yöntemi ile besi yerlerine ekim yapılmışlardır. Surico ve ark. (1989) tarafından yarı seçici besi yeri PVF-1 kullanılmıştır. Bizim çalışmamızda ilk izolasyonlar SNA besi yerine yapılmış ve daha sonra PVF-1 besi yeri kullanılarak başarılı sonuçlar elde edilmiştir.

Günümüzde mikroorganizmaların tanısında her ne kadar moleküler tekniklerin kullanılması hızla yaygınlaşsa da klasik tanı teknikleri birçok araştırıcı için hala güncelliğini korumaktadır. Bunun en önemli nedeni ise tanılanmak istenen mikroorganizma gruplarının belirlenmesi ve takip eden moleküler çalışmalara hız kazandırmasıdır. Bu nedenle bizim çalışmamızda da izole edilen bakteriyel izolatların moleküler tanılarının yanı sıra morfolojik ve biyokimyasal karakterleri de belirlenmiştir.

Đzolasyon çalışmaları sonunda 85 Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatının ülkemizde yaygın olarak yetiştiriciliği yapılan Yamalak Sarısı zeytin çeşidinde ur oluşturduğu

gözlenmiştir. Denemelerimizde zeytin izolatlarının zeytinde ur oluşturduğu fakat zakkum da yapılan patojaniste testlerinde bazı izolatların ur oluşturmadığı gözlenmiştir.

Surico ve ark. (1984) zeytin, zakkum ve kurtbağrı izolatları ile yürüttüğü çapraz inokulasyon denemelerinde zeytin izolatlarının zeytinde ur oluşturduğunu, ancak bir zeytin izolatının zakkumda da ur oluşturabildiğini, tüm zakkum izolatlarının ise hem zeytinde hem de zakkumda urlara neden olabildiğini, kurtbağrı izolatlarını ise sadece zeytinde ur oluşturduğunu belirtmişlerdir. Aynı şekilde Panagopoulos (1993) zeytin izolatlarının sadece zeytinde ur oluşturduğunu, zakkum izolatlarının ise kendi konukçusu olan zakkum dışında,

zeytinde de ur oluşturduğu ve yasemin izolatlarının da sadece zeytinde ur oluşturduğunu bildirmiştir. Caponero ve ark. (1995) 11 zeytin izolatının sadece zeytinde patojen olduğunu, zakkum izolatlarının hem zakkum hem de zeytinde ur oluşturduğunu gözlediklerini bildirmişlerdir. Đspanya'da ise zeytin izolatlarının sadece zeytinde ur oluşturduğu, zakkum izolatlarının hem zeytinde hem de zakkumda ur oluşturduğunu, kurtbağrı izolatlarının ise sadece kurtbağrı bitkisinde ur oluşturduğu ve Rethama sphaerocarpha izolatının ise sadece konukçusunda virulent olduğu belirtilmiştir (Alvarez ve ark., 1988).

Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatlarının farklı besi yerlerinde koloni

karakteristikleri ve biyokimyasal testler yönünden elde edilen bulgular, verilmiştir.

Çalışmamızda P. s. pv. savastanoi izolatlarının hepsi SNA'da levan kolani

oluşturmamıştır. 85 tane P. s. pv. savastanoi izolatı, king b besiyerinde fluoresans pigment üretirken 44 tanesinin üretmediği saptanmıştır. Sonuçlarımıza benzerlik gösteren diğer çalışmalar da ise Iacobellis ve ark., (1993) Đtalya' da elde edilen P. s. pv. savastanoi izolatlarının SNA'da levan negatif ve KB'de fluoresans üretmeyen izolatlar elde ettiklerini bildirmişlerdir. Ayrıca zeytinden izole edilen izolatlar içinde P. s. pv. savastanoi için tipik olmayan levan negatif izolatlar elde edildiğini belirtmişlerdir.

P. s. pv. savastanoi izolatlarımız arasında King B besi yerinde UV ışık altında

fluoresans vermeleri açısından farklılıklar bulunmuştur. Yapılan diğer çalışmalar da aynı şekilde değişken sonuçların elde edildiğini belirtmektedir. Bu konu ile ilgili ileriki çalışmalarda King B izolasyon çalışmalarının dışında farklı konukçu bitki izolatların arasında fluoresans verme durumlarının incelenmesi gerekir.

Tüm Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatlarımız jelatin hidrolizi ve eskulin hidrolizi testlerinde değişmeksizin negatif sonuç vererek diğer çalışmalarla benzerlik göstermiştir. Aynı şekilde eritritol, ksiloz, rafinoz ve gliserol karbon kaynaklarını

kullanım test sonuçlarımız belirtildiği gibi diğer araştırıcıların Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatlarında bulduğu sonuçlar ile benzer bulunmuştur.

Schaad ve ark. (2001)' e göre P. s. pv. savastanoi 3 7°C' de geliştiği belirtilmiştir ancak bizim çalışmamızda P. s. pv. savastanoi izolatının hepsi gelişme göstermiştir. Ancak sellobioz kullanımı testinde değişmeksizin negatif sonuç tarafımızca bulunurken, diğer araştırıcılar tarafından bu test pozitif olarak verilmiştir.

Trehaloz, sorbitol ve sakkaroz kullanımı bakımından P. s. pv. savastanoi

izolatlarının testlerinde elde ettiğimiz sonuçlar Alvarez ve ark. (l988) elde ettiği sonuçlar ile benzer bulunmuştur.

Çalışmamızda P. s. pv. savastanoiizolatlarının organik asit kullanımları açısından benzer sonuçlar verdiği gözlenmiştir. Lacaobellis ve ark., (1993)'de malonik asit ve l- tartarik asit kullanımı açısından izolatlar arasında değişken olduğunu bildirmişlerdir.

Bitkinin dallarında ve bitkinin diğer kısımlarında, örneğin; hastalık bulgusu olmayan yapraklar, yaşayan bakteriyel patojenlerin saptanması çoğu zaman zor olmaktadır çünkü hedef organizma populasyonu diğer bakterilerin miktarına göre genellikle azdır. Klasik izolasyon yöntemleri çok duyarlı olabilir ancak örneklerde çok az miktarda patojen ve yüksek sayıda diğer bakterilerden buluyorsa başarısızdır (Schaad, 1989). Serolojik teknikler hızlı ve ucuz olmasına rağmen genellikle duyarlılık ve bazı durumlarda özgüllükten yoksundur (Hampton ve ark., 1990).

Moleküler tekniklerden DNA amplifikasyonu (PCR) son yıllarda bitki patojenlerinin kesin tanılarının yapılmasında tercih edilen bir yöntemdir (Tenover, 1989; Visidi ve Yolken, 1987; Innis ve ark., 1990; Ehlich ve ark., 1991, Leite ve ark., 1995; Jeng ve ark., 2001; Basım, 2002; Bej ve ark., 1991a; Bej ve ark., 1991b; Steffan ve Atlas, 1991). Mikrobiyal tanıda değişik PCR teknikleri kullanılabilir (Louws ve ark., 1994; Arnold ve ark., 1996; Lee ve ark., 1997; Scortichini ve ark., 2001).

Ayrıca üzerinde hiçbir hastalık belirtisi bulunmayan zeytin dallarından alınan örneklerde de yapılan PCR tekniği ile Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi’ye rastlanılmıştır.

Penyalver (2000), isimli araştırıcı iaaL geninin primerleri ile amplifikasyonu gerçekleştirerek 454 bp bant oluşumunu ve Sisto (2004), isimli araştırıcı hrcC geninin primerleri ile amplifikasyonu gerçekleştirerek 593 bp bant oluşumunu belirlemişlerdir. Çalışmalarımızda da her iki primer kullanılarak aynı bulgular elde edilerek P.s.pv. savastanoi nin tanısı yapılmıştır.

Çalışmamızda Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatlarının PCR tanılaması yapılmış ve çalışmada Penyalver ve ark. (2000), Sisto ve ark. (2004)’ın HRC geninin saptanması metodu değiştirerek uygulamış, 0.5 ml. hücre süspansiyonu 15 dakika kaynatılmış, 10 dakika 16110 g’de mikro santrifüjle ayrıştırılmış, çökelti ayrılmış ve süpernattan 2µL’lik kısım çoğaltım için kullanılmıştır. Bizim çalışmamızda da bu modifiye yöntem kullanılmış ve başarılı sonuçlar elde edilmiştir.

Yapılan çalışmalar moleküler metotların her birinin tanı için kendi başına yeterli olduğunu göstermiştir. Ancak tanı ve karakterizasyonda birden fazla metodun bir arada kullanılmasının sonuçların güvenilirliğini artırdığı ve bir metotla tespit edilemeyen özelliğin diğeriyle belirlenmesini sağladığı görülmüştür.

Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatları ile ilgili bulgular değerlendirildiğinde izolatlar arasında gerek biyokimyasal testler, gerekse farklı konukçulardaki patojeniste sonuçları bakımından farklılıklar göstermiştir. Bu bulgular Surico ve ark., (1984, 1989), Iacobellis et al. (1993, 1995), Panagopoulos (1993), Mugnai ve ark.,. (1994), Caponero ve ark., (1995) tarafından da desteklenmektedir. Alvarez ve ark., (1998) farklı konukçulardan 160 P.s.pv. savastanoi izolatının fenotipik çeşitliliğini araştırdığı çalışmasında sonuç olarak Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatlarının fenotipik olarak heterojen bir yapıda olduğunu, biyokimyasal özelliklerdeki bu

heterojenliğin çevresel faktörlerden, konukçu bitkiden kaynaklanabileceğini ya da farklı patovarları olabileceğini belirtmiştir.