As comunidades microbianas portam a maioria das rotas bioquímicas e são responsáveis diretas pelos ciclos biogeoquímicos no planeta. Essas rotas têm uma distribuição ampla nos diversos táxons conhecidos.
Dados metagenômicos produzidos por sequenciamento shotgun em larga escala, resultando em milhões de fragmentos de algumas centenas de pares de bases, têm fornecido subsídio para a identificação dos componentes das comunidades microbianas e para montagens de genomas parciais ou completos, mas trouxe o desafio de integrar todos esses dados de forma a fornecerem informações acerca das relações entre espécies e relações com o ambiente.
Os microbiomas objetos desta tese são bastante diferentes. De um lado o Lago São Francisco, um reservatório artificial que consiste no maior corpo d‟água do parque, sujeito a fatores climáticos, receptor de água de nascentes, residência de aves migratórias e não-migratórias e mamíferos. De outro lado o sistema de compostagem de resíduos orgânicos produzidos no parque, um ambiente confinado, com substrato complexo de várias origens: podas, restos de alimentos dos animais e fezes.
Este trabalho foi desenvolvido para estabelecer uma metodologia de estudos do potencial metabólico de microbiomas que possa ser aplicada em dados metagenômicos seriais. O artigo “Metabolic Reconstruction for Metagenomic Data and Its Application to the Human Microbiome” (ABUBUCKER et al.,2012) foi um dos pilares da abordagem deste projeto. Neste artigo os autores descrevem o funcionamento do programa HUMAnN bem como sua aplicação no estudo de microbiomas associados a humanos. A consistência dos resultados descritos nos estimulou a aplicar uma abordagem semelhante aos metagenomas oriundos de ambientes da Fundação Parque Zoológico.
De forma geral a aplicação do programa HUMAnN gerou resultados significativos, não só em relação ao potencial metabólico das comunidades
118 microbianas mas também em relação a futuros estudos metagenômicos e metatranscritômicos integrados. Todos os conjuntos de dados puderam ser analisados de forma simples e sem distinção da tecnologia de sequenciamento 454 ou Illumina, mas para evitar distorções foi aplicada uma normalização simples em função do tamanho do metagenoma em questão.
A metodologia aplicada permitiu reconhecer a variação do potencial metabólico na forma de variação da abundância relativa de módulos KEGG. Vários módulos tiveram variação mais ou menos significativa e a variação de alguns deles coincidiu, como descrito, com a variação de táxons ou de fatores ambientais, abrindo caminho para investigações futuras sobre quais táxons estão contribuindo com quais rotas. Já a análise computacional do potencial metabólico compostagem, por se tratar de um processo complexo desempenhado por um consórcio de microrganismos num sistema fechado, teve como etapa crítica o estabelecimento do que é super-representado ou sub-representado em um determinado momento. É factível que todas as rotas metabólicas conhecidas estejam representadas em maior ou menor grau, em parte devido à complexidade do “inóculo” inicial, ou seja, o conjunto de microrganismos presentes no material utilizado na montagem da composteira.
Como perspectiva futura, com mencionado acima, um estudo metatranscritômico será realizado com aplicação do programa HUMAnN e outras análises estatísticas com o intuito de esclarecer quais genes previstos no potencial metabólico estão efetivamente expressos e se há alguma correlação entre a abundância de uma rota e a expressão de algum de seus componentes. Para tanto amostras de RNA mensageiro foram sequenciadas e serão num futuro próximo analisadas.
Para averiguar se há possíveis relações de interdependência entre as espécies identificadas nos microbiomas do Parque Zoológico, considerando produtos metabólicos produzidos por uma espécie (sementes) e utilizados e não produzido por outras, será empregado o algoritmo NetSeed proposto por Borenstein e colaboradores (BORENSTEIN et al., 2008; COTTRET et al., 2010), que se baseia em teoria dos grafos e constrói redes metabólicas para os organismos com informações depositadas em bancos de dados como KEGG. Dois outros artigos que merecem destaque são “Large-scale reconstruction and phylogenetic analysis of
119 metabolic environments” (BORENSTEIN et al., 2008) e “Metabolic modeling of species interaction in the human microbiome elucidates community-level assembly rules” (LEVY & BORENSTEIN, 2013). No primeiro consta a descrição do algoritmo NetSeed e a análise do conjunto de compostos exógenos necessários para a sobrevivência de 478 espécies de microrganismos bem como as implicações para a determinação do habitat. O segundo descreve a aplicação da mesma abordagem a dados de microbiomas humanos com um delineamento da coocorrência de microrganismos, suas relações e o papel do hospedeiro em seu estabelecimento. Esta abordagem pode ser adaptada para outros dados metagenômicos e no caso do processo de compostagem pode fornecer dados importantes para a compreensão do estabelecimento e do papel dos microrganismos atuantes.
Deste trabalho resultou até o momento uma coautoria num artigo descrevendo resultados preliminares da análise de duas composteiras (MARTINS et al., 2013). Em breve deveremos submeter um manuscrito de primeira autoria correspondente ao capítulo 2 desta tese e outro manuscrito de coautoria em que nossa contribuição é o que consta aqui como capítulo 3.
REFERÊNCIAS
ABUBUCKER, S.; SEGATA, N.; GOLL, J.; SCHUBERT, A. M; IZARD, J.; CANTAREL, B. L.; RODRIGUEZ-MUELLER, B.; ZUCKER, J.; THIAGARAJAN, M.; HENRISSAT, B.; WHITE, O.; KELLEY, S. T.; METHE, B.; SCHLOSS, P. D.;
GEVERS, P.; MITREVA, M.; HUTTENHOWER, C. Metabolic Reconstruction for Metagenomic Data and Its Application to the Human Microbiome. PLoS
Computational Biology, v. 8, n. 6, p. 1 – 17, 2012.
BORENSTEIN, E.; KUPIEC, M.; FELDMAN, M. W.; RUPPIN, E. Large-scale reconstruction and phylogenetic analysis of metabolic environments. Proceedings of
the National Academy of Sciences, v. 105, n. 38, p. 14482 – 14487, 2008.
COTTRET, L.; MILREU, P. V.; ACUÑA, V.; MARCHETTI-SPACCAMELA, A.; STOUGIE, L.; CHARLES, H.; SAGOT, M. F. Graph-Based Analysis of the Metabolic Exchanges between Two Co-Resident Intracellular Symbionts, Baumannia cicadellinicola and Sulcia muelleri, with Their Insect Host, Homalodisca coagulata.
120 LEVY, R.; BORENSTEIN, B. Metabolic modeling of species interaction in the human microbiome elucidates community-level assembly rules. Proceedings of the
National Academy of Sciences, v. 110, n. 31, p. 12804 – 12809, 2013.
MARTINS, L. F.; ANTUNES, L. P.; PASCON, R. C.; OLIVEIRA, J. C. F.; DIGIAMPIETRI, L. A.; BARBOSA, D.; PEIXOTO, B. M.; VALLIM, M. A.; VIANA- NIERO, C.; OSTROSKI, E. H.; TELLES, G. P.; DIAS, Z.; CRUZ, J. B.; JULIANO, L.; VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; SILVA, A. M.; SETUBAL, J. C. Metagenomic Analysis of a Tropical Composting Operation at the São Paulo Zoo Park Reveals Diversity of Biomass Degradation Functions and Organisms. PLoS ONE, v. 8, n. 4, p 1 – 13, 2013.