Tão fundamental quanto desenvolver bioensaios de angiogênese é estabelecer métodos acurados e reprodutíveis para quantificar a resposta neovascular e, assim, mensurar o efeito do estímulo angiogênico ou avaliar a eficácia de potenciais inibidores (CONRAD et al., 1994; ZICHE, 2001). Nesse sentido, descreveram-se diversos métodos para quantificar a angiogênese corneana. Os mais simples consistem em verificar se a neovascularização está presente ou ausente (GLAT; KLINTWORTH, 1986; PROIA et al., 1988), ou se os vasos neoformados alcançaram o local do estímulo, o que seria considerado uma resposta positiva (PROIA et al., 1988; VOLPERT et al., 1996; VOLPERT et al., 1998; HERNÁNDEZ et al., 2001). O crescimento neovascular pode ainda ser expresso através de uma escala de gradação: 0 a 3 ou 0 a 4. Na primeira escala, grau 0 denota ausência; grau 1, leve; grau 2, moderada e grau 3, intensa atividade angiogênica (KONYA et al., 2005). Na segunda, os valores representam, em termos percentuais, o quanto da área entre o limbo e o estímulo está sendo ocupada pela neovascularização: grau 0, ausência de angiogênese; 1, 1 a 25%; 2, 26 a 50%; 3, 51 a 75%; 4, acima de 75% (VASSE et al., 1999; MURATA et al., 2006). Outra forma de estimar a angiogênese corneana é através da contagem do número total de neovasos na córnea (BREM; FOLKMAN, 1975), do número de neovasos que partem do limbo em direção ao estímulo (JOUSSEN; GERMANN; KIRCHHOF, 1999; SCHWARZ et al., 1999; ZHENG et al., 2001b; LEE et al., 2002; JEONG et al., 2003) ou ainda do número de neovasos na fronteira de crescimento da zona de neovascularização (KRUSE et al., 1998; JOUSSEN et al., 1999).
Usualmente, o comprimento vascular radial máximo, equivalente à distância entre o limbo e a extremidade central do maior vaso (GROSS et al., 1981; CAO et al., 1995; CAO et al., 1996; VOEST et al., 1995; KENYON et al., 1996; CAO
et al., 1998; CAO et al., 1999; JOUSSEN; GERMANN; KIRCHHOF, 1999; JOUSSEN et al., 1999; CAO et al., 2001; SEO et al., 2001; EKSTRAND et al., 2003; WU et al.,
2003), ou médio, correspondente à média das medidas do comprimento vascular radial em pontos determinados da área de neovascularização (BREM; FOLKMAN, 1975; MASFERRER et al., 2000; LEAHY et al., 2002), são utilizados como parâmetros para quantificar a atividade angiogênica. O comprimento vascular radial é geralmente acompanhado pela determinação do arco da circunferência corneana envolvido pela neovascularização, cuja medida pode ser representada pelo seu comprimento ou pelo ângulo central correspondente; sendo este medido em graus ou mais comumente expresso como horas do relógio, onde 1 hora equivale a 30° (CAO et al., 1995; VOEST et al., 1995; CAO et al., 1996; KENYON et al., 1996; CAO
et al., 1998; CAO et al., 1999; CAO et al., 2001; SEO et al., 2001; EKSTRAND et al.,
2003; WU et al., 2003). Sob visão microscópica (estereomicroscópio ou biomicroscópio), tais parâmetros podem ser mensurados mediante o uso de um paquímetro (JOUSSEN; GERMANN; KIRCHHOF, 1999; WU et al., 2003) ou de uma ocular apropriada (micrômetro ocular), equipada com uma escala linear com precisão de décimos de milímetro (GIMBRONE et al., 1974; KENYON et al., 1996; ZICHE, 2001) ou uma escala angular em graus (KENYON et al., 1996; SEO et al., 2001).
As medidas do comprimento vascular radial e do arco da circunferência corneana correspondente à zona de angiogênese podem ser combinadas para calcular áreas que constituem uma aproximação ou estimativa da real área ocupada pela neovascularização. Sendo assim, tais parâmetros podem ser relacionados à base e à altura de um triângulo, cuja área seria então facilmente determinada (PROIA et al., 1988; CONRAD et al., 1994; BENEZRA et al., 1997), ou aos eixos maior e menor de uma elipse e assim calcular o valor de metade de sua área ― a região de angiogênese corresponderia à superfície de uma semi-elipse (KENYON; BROWNE; D’AMATO, 1997; O’LEARY et al., 1999; SCHWARZ et al., 1999; KUO et
al., 2001; ZHENG et al., 2001b; LEE et al., 2002; ZHENG et al., 2002; KIM et al.,
calcula a área de um setor de coroa circular (D’AMATO et al., 1994; MASFERRER et
al., 2000; SEO et al., 2001; LEAHY et al., 2002).
Uma outra abordagem consiste em determinar um índice de angiogênese através da multiplicação do comprimento vascular radial pela densidade de vasos, isto é, o número de neovasos observados na extremidade distal (fronteira de crescimento) da zona de neovascularização (número de vasos distais), normalizado para o intervalo de 1 a 5. Dessa forma, quando o número de neovasos está entre 0 e 25, normaliza-se para o valor 1; entre 26 e 50, para o valor 2; entre 51 e 75, para o valor 3; entre 76 e 100, para o valor 4; acima de 100, normaliza-se para o valor 5 (ZICHE et al., 1994; ZICHE et al., 1997; MARCONCINI et al., 1999; GONZÁLEZ et
al., 2000; GONZÁLEZ et al., 2001; ZICHE, 2001).
Glat e Klintworth (1986) propuseram uma técnica morfométrica baseada no princípio de que o comprimento de uma linha curva é proporcional ao número de vezes que esta intercepta uma grade de linhas paralelas a ela sobreposta. De acordo com esse método, após a indução de neovascularização corneana mediante a cauterização com nitrato de prata, camundongos eram submetidos a perfusão com tinta da Índia, que é composta de partículas pretas em estado coloidal. Dessa forma, o sangue era substituído pela tinta da Índia e os vasos, por ela preenchidos, rotulados na cor preta. Em seguida, o olho era enucleado e colocado em substância fixadora por no mínimo 24 horas. Após isto, a córnea era removida, mantendo-se um anel de tecido escleral adjacente, e aplanada através de três incisões radiais periféricas, possibilitando assim a montagem em lâminas (flat-mounted cornea). Fotografias convencionais da córnea montada eram obtidas, às quais uma grade de linhas horizontais, paralelas e descontínuas era sobreposta. O comprimento vascular total era então avaliado de forma indireta pela determinação do número de intersecções entre as linhas da grade e os vasos corneanos preenchidos pela tinta da Índia.
A técnica de enfatização da neovascularização corneana mediante a perfusão com tinta da Índia ― e subseqüente remoção, aplanamento (através de 3 ou 4 incisões radiais) e montagem da córnea em lâminas ― é bastante utilizada (PROIA et al., 1988; BENELLI et al., 1998; BOCCI et al., 1999; EDELMAN; CASTRO; WEN, 1999; GU et al., 1999; SENNLAUB; CURTOIS; GOUREAU, 1999; KLOTZ et al., 2000; SHAN et al., 2001; ZHENG et al., 2001a; WHITE et al., 2003), uma vez que facilita sobremaneira a quantificação da resposta angiogênica, seja por
métodos manuais ou automáticos. Todavia, permite apenas uma única mensuração, já que o animal necessita ser sacrificado. Em outros estudos, em vez de tinta da Índia, utilizou-se o carbono coloidal como marcador vascular (GIMBRONE et al., 1974; BREM; FOLKMAN, 1975; VOLPERT et al., 1996; VOLPERT et al., 1998; KON
et al., 2003; PINTO; MALUCELLI, 2002).