Antibiyotik duyarlılık testleri
Tünger A, Çavuşoğlu C, Korkmaz M. Asya Mikrobiyoloji. 1. baskı, İzmir, Asya Tıp Kitabevi. 2005
Tekeli A, Ustaçelebi Ş. Çeviri Editörler, Moleküler Mikrobiyoloji Tanı Prensipleri ve Uygulamalar, Ankara; Palme Yayıncılık. 2006
Başustaoğlu A, Kubar A, Yıldıran ŞT, Tanyüksel M. Çeviri Editörler, Klinik Mikrobiyoloji, 9. Baskı, Ankara, Atlas Kitapçılık. 2009
Başustaoğlu A, Yıldıran ŞT. Çeviri Editörler, Klinik Mikrobiyoloji Yöntemleri El Kitabı, 3.
Baskı, Ankara, Atlas Kitapçılık. 2007
Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. 4. baskı, Ankara, Fakülteler Kitabevi. 2004
Bakterilerde antibiyotiklere karşı direnç
Enfeksiyon etkenlerinde antibiyotiklere direnç, tüm dünyada insan sağlığını tehdit eden en önemli
sorunlardan biridir
Bakterilerde son 25 yıldır çok sayıda direnç fenotipi ortaya çıkmış ve yaygın hale gelmiştir
Çoklu dirençli mikroorganizmalar sadece hastanelerde değil, toplumda da görülmeye başlanmıştır
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Yapısal (intrinsik) direnç
Bir mikroorganizmanın yapısı nedeniyle antibiyotiklere karşı dirençli oluşu
Türün tüm üyeleri için söz konusudur
Örneğin, bir çok gram negatif bakteri vankomisin ve metisiline, enterokoklar ise sefalosporinlere duvar yapıları nedeniyle yapısal olarak dirençlidirler
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Edinsel direnç
Yapısal veya düzenleyici genlerdeki mutasyonlar, ya da yeni bir DNA kazanılması veya bu iki
mekanizmanın kombinasyonu ile ortaya çıkmaktadır
Aynı türün tüm bireylerinde değil, duyarlı bir atadan gelen belirli bir bakteri soyunda ortaya çıkmaktadır
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Bakterilerin antimikrobik ilaçlara karşı gösterdiği direnç mekanizmaları dört ana başlık altında toplanabilir
Hücredeki antibiyotik miktarının azaltılması
Dış membran geçirgenliğinin azaltılması
İç membrandan geçişin engellenmesi
Aktif atım pompası olabilir
İlacın hedefinde değişiklik oluşturulması
Mutasyon ile
Enzimatik değişiklik ile oluşabilir
Sentezlenen enzimle ilacın inaktive edilmesi
Antimikrobik ilaçtan etkilenmeyen farklı bir metabolik yol kullanılması
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Kromozomal mutasyon ve seleksiyon sonucu oluşan edinsel direnç, kromozomda bir spontan mutasyon oluşması sonucu ortaya çıkmaktadır
DNA replikasyonu sırasında her gende 10-9 ila 10-10 sıklığında rastgele baz değişikliği olmaktadır
Ayrıca kopyalama sırasındaki hatalar belirli genlerin kısmen veya tamamen delesyonuna neden
olabilmektedir
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Sonuçta
ilacın hedefinde değişiklik olabilir,
ilaç inaktivasyonu ve atım pompa sistemlerinin ifadesi artabilir ya da azalabilir,
porin ve aktif taşıyıcılar kaybedilebilir veya aktive edilebilir
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Ortamda bulunan antibiyotikler yeni mutantların çıkışına yol açmamaktadır
Ancak duyarlı mikroorganizmalar baskılanacağı için dirençli mutantların seleksiyonuna neden olmaktadır
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Bakteriler dirençli mikroorganizmalardan yeni genetik madde alarak direnç kazanabilir
Genetik madde geçişi;
Konjugasyon
Transdüksiyon
Transformasyon ile oluşabilmektedir
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Konjugasyon
Gram negatif bir bakteriden direnç genlerini içeren
plazmidin pilus adı verilen bir protein uzantıdan duyarlı bakteriye geçmesidir
Gram pozitif bakterilerde ise konjugasyon genellikle verici ve alıcı bakterilerin bir araya toplanmasını
kolaylaştıran cinsel feromonların salgılanması ile başlatılmaktadır
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Konjugasyon
Plazmidler kromozomdan bağımsız olarak replike olan, kromozom dışı genetik elementlerdir
Klinikte görülen direnç daha çok plazmidlere bağlıdır R-plazmidi adı verilen direnç plazmidleri, sayıları 10’a varabilen farklı antibiyotiğe karşı direnç genlerini
taşımaktadır
R-plazmidi içeren bakteriler bu özelliklerini duyarlı
bakterilere aktararak onların da dirençli hale gelmesine neden olmaktadır
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Konjugasyon
Son yıllarda bazı transpozon veya plazmidlerde
“integron” adı verilen ve küçük hareketli elementleri içeren genetik yapılar bulunmuştur
Bazı integronlar hareketli, bazıları ise kromozomaldir Bir bakterinin çok kısa bir süre içinde birçok antibiyotiğe birden çoklu dirençli duruma gelişinde bu elementlerin rolü olduğu anlaşılmıştır
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Transdüksiyon
Direnç genleri bakteriyofaj aracılığı ile bir bakteriden diğerine geçmektedir
Antibiyotik direnci kodlayan geni içeren virus (faj) alıcı bakteriye bu geni taşımaktadır
Bu mekanizma oldukça ender görülmektedir
Antibiyotik direnç mekanizmaları
Transformasyon
Bu mekanizmada bakteriler bir bakterinin lizisi ile ortama dağılan DNA parçacıklarını kendi DNA’larına katmaktadır Bu mekanizmaya en iyi örnek Streptococcus
pneumoniae’de penisilin ve sefalosporinlere karşı oluşan dirençtir
β-Laktam antibiyotiklere karşı direnç mekanizmaları
Tüm β-laktam antibiyotikler bakterilerde hücre duvarı sentezini inhibe ederek bakterisidal etki göstermektedir Bakterilerde β-Laktam antibiyotiklere karşı oluşan direnç üç yolla gelişebilmektedir
Penisilin bağlayan proteinlerde (PBP) oluşan
değişiklikler ile antibiyotiğin hedefine bağlanması engellenebilir
Dış membran proteinlerinin (OMP) ifadesinde azalma veya atım pompaları ile ilacın hücre içine girişi
önlenebilir
β-laktamaz enzimleri ile antibiyotik inaktive edilebilir
Aminoglikozid grubu antibiyotiklere karşı direnç mekanizmaları
Aminoglikozidler ribozamların 30s alt birimine bağlanarak protein sentezini inhibe etmektedir Ayrıca hücre duvarındaki polisakkaritleri birbirine bağlayan Mg+2 ve Ca+2’nin yerine geçerek,
hücre duvarında delikler oluşmasına ve
sonuçta hücre duvarının permeabilitesinin bozulmasına yol açmaktadır
Aminoglikozid grubu antibiyotiklere karşı direnç mekanizmaları
Gram pozitif ve gram negatif bakterilerde aminoglikozidlere karşı direnç
ribozomal hedeflerde değişiklik,
antibiyotiğin hücreden atımı veya
enzimatik yolla oluşabilmektedir
Ancak aminoglikozidlere karşı kazanılan dirençte en önemli olan mekanizma
«aminoglikozidleri değiştiren enzimler» ile bu antibiyotiklerin amino ya da hidroksil gruplarının enzimatik olarak değiştirilmesidir
Aminoglikozid grubu antibiyotiklere karşı direnç mekanizmaları
Değişim sonucu aminoglikozid molekülü ribozomlara iyi bağlanamadığından bakteri aminoglikozide direnç
göstermektedir
Aminoglikozid molekülünü değiştiren üç enzim ailesi tanımlanmıştır
Aminoglikozid fosfatransferazlar (APH)
Aminoglikozid asetiltransferazlar (AAC)
Aminoglikozid nükleotidiltransferazlar (ANT)
Kinolon grubu antibiyotiklere direnç
Kinolonlar bakterilerde DNA replikasyonu için gerekli olan iki tip topoizomeraz;
DNA giraz ve topoizomeraz IV ile etkileşime girerek DNA sentezini durdurmaktadır
Kinolon grubu antibiyotiklerde direnç;
Hedef enzimlerdeki mutasyonlara
Geçirgenlikte azalmaya
Antibiyotiğin aktif atımına bağlı olabilmektedir
Bunların tümü kromozomal mutasyon sonucu olmaktadır
Glikopeptid antibiyotiklere direnç
Enterokoklar’da glikopeptid direnci
Glikopeptid grubu antibiyotikler
hücre duvarı yapımı sırasında pentapeptid
prekürsöründeki D-alanin-D-alanin’e non-kovalent olarak bağlanarak prekürsörün hücre duvar yapısına girmesini engellemkete,
böylece hücre duvar sentezini erken evrede önlemektedir
Glikopeptid antibiyotiklere direnç
Enterokoklar’da glikopeptid direnci
Enterococcus türlerinde ifade ve direnç düzeyi yönünden farklılık gösteren altı farklı fenotipte glikopeptid direnci saptanmıştır
beşi (VanA, B, D, E ve G) edinilmiş,
biri (VanC) yapısal özelliktedir
Makrolid-Linkosamid-Streptogramin direnci
Makrolid, linkosamid ve streptogramin antibiyotikler (MLS) kimyasal olarak farklıdır
Ancak biyolojik özellikleri ve etki mekanizmaları benzer olan, bakterilerde 50s ribozomlara bağlanarak protein sentezini inhibe eden antibiyotiklerdir
Makrolid-Linkosamid-Streptogramin direnci
Gram negatif bakteriler dış membranları nedeniyle bu antibiyotiklere yapısal olarak dirençlidir
Gram pozitif bakteriler ise üç değişik mekanizma ile direnç oluşturmaktadır
Antibiyotiğin hedefinde değişiklik olması
Antibiyotiğin inaktive edilmesi
Antibiyotiğin aktif olarak hücre dışına pompalanması
Kloramfenikol direnci
Kloramfenikol, bakteri hücresinde ribozomların 50s alt birimine bağlanarak protein sentezini inhibe etmektedir Bu antibiyotiğe karşı direnç,
kloramfenikolü modifiye eden «kloramfenikol
asetiltransferaz (CAT)» enziminin sentezlenmesi sonucu oluşmaktadır
Gram pozitif ve gram negatif bakterilerde bu enzimin sentezi çoğunlukla plazmid kontrolündedir
Rifampin direnci
Rifampin bakterilerde DNA’ya bağlı RNA polimeraz enziminin β alt birimine bağlanarak protein sentezini inhibe etmektedir
Bakteride rifampin direnci,
DNA’ya bağlı RNA polimeraz enziminin β-alt birimini kodlayan rpoB genindeki nokta mutasyonları sonucu oluşmaktadır
Mutasyonlar çok yüksek sıklıkta oluşmaktadır
Tetrasiklin direnci
Tetrasiklin, amino açil-tRNA’nın ribozoma bağlanmasını önleyerek tRNA ile mRNA arasındaki kodon-antikodon etkileşiminin bozulmasına ve sonuçta 30s ribozomda protein sentezinin inhibisyonuna yol açmaktadır
Bakteride tetrasiklin direnci
sitoplazmik membrandaki proteinler ile ilacın enerjiye bağlı olarak hücre dışına pompalanması
ribozomal koruyucu proteinler
enzimatik olarak ilacın inaktive edilmesi, ile oluşabilmektedir
Antibiyotik duyarlılık testleri
Bir antimikrobiyal ajanın belli bir bakteri türüne karşı in- vitro etkinliğini saptamak amacıyla uygulanan testlerdir Klinikte antimikrobiyal tedavinin, duyarlılık testlerinin sonuçlarına göre belirlenmesi esastır
Antibiyotik duyarlılık testleri
Antibakteriyel duyarlılık testleri başlıca iki metoda ayrılır
Difüzyon temelli testler
Disk difüzyon testi
Gradyan difüzyon yöntemi (E-test)
Dilüsyon temelli testler
Tüp dilüsyon
Mikrodilüsyon testleri
Makrodilüsyon testleri
Agar dilüsyon
İnokülasyon işlemi
MİK değerini önemli ölçüde etkiler DİKKAT edilmeli
Standardizasyonu iki yöntemle yapılabilir
İnokülasyon işlemi
Birinci yöntem;
Taze kültürden 4-5 koloni alınır
(triptik soya buyyon)
Bulanıklık oluşuncaya kadar 35oC’de inkübe edilir
0,5 McFarland
bulanıklığına kadar sulandırılır
İkinci yöntem;
Katı besiyerinde üreyen koloniden direkt süspansiyon yapılır
0,5 McFarland
bulanıklığına ayarlanır
İnokülasyon işlemi
Baryum sülfat;
%1 H2SO4’den 9.9 ml
%1.175
BaCl2.2H2O’den 0.1 ml
Karıştır
Saf su ile birebir sulandır
McFarland cihazı;
Dansitometrik ölçüm
565 dalga boyu
Difüzyon testleri
Disk difüzyon testi
Kirby-Bauer tarafından geliştirilmiştir ve bu isimle de anılmaktadır
Rutin laboratuvarlarda antibiyotik duyarlılığının saptanmasında en sık olarak kullanılan yöntemdir Uygulaması ucuz ve basit bir metod
Difüzyon testleri
Disk difüzyon testi
Testin uygulanışı;
Test edilecek antibiyotiğin belirlenmiş miktarının emdirilmiş olduğu kağıt diskler bakterinin inoküle edildiği agar yüzeyine yerleştirilir
Kağıt diskteki antibiyotik agar içine yayılır
Diskten uzaklaştıkça antibiyotik konsantrasyonu logaritmik olarak azalır
Disk çevresinde antibiyotik konsantrasyonunun yüksek olduğu alanda bakteri üremesi engellenir
İnhibisyon zonu oluşur
Difüzyon testleri
Disk difüzyon testi
Besiyeri;
Önerilen besiyeri MHA’dır
Üretim serileri arasında tutarlılık olması
Sülfonamid, trimetoprim ve tetrasiklin inhibitörleri içermemesi
Kolay ureyen bakterilerin birçoğunu üremesi için yeterli olması
Yeterli deneyim ve bilgi birikimi bulunması
Önemli noktalar
Agar derinliği 4 mm olmalı
pH 7,2-7,4 olmalı
Besiyeri yüzeyinin ıslak olmaması
Difüzyon testleri
Disk difüzyon testi
Diskler;
15 dk içinde yerleştirilmeli
Aralarında 24 mm uzaklık olmalı
Birbirleri ile kesişmemesi için
150 mm’lik petrilere ….. 12 disk
100 mm’lik petrilere ….. 5 disk
Agar yüzeyine temas eden diskin yeri değiştirilmemeli
Difüzyon testleri
Disk difüzyon testi
İnkübasyon;
Diskler yerleştirildikten sonra 15 dk içinde kaldırılmalı
Kapak altta olmalı
35oC’de oda atmosferinde 16-18 saat inkübasyon
Oksasilin ve vankomisin 24 saat inkübasyon
Difüzyon testleri
Disk difüzyon testi
Sonuçların yorumlanması;
İnokülasyon doğru yapılmış ise, zon çapları düzgün daire şeklinde olur
Kolonilerin ayrı ayrı görüldüğü
üreme inokülüm yoğunluğunun az olduğunu gösterir
Test tekrarı
15 mm
6 mm
Difüzyon testleri
Disk difüzyon testi
Avantajları;
Uygulama basit, tutarlılığı yüksek
Maliyet düşük
Özel ekipmanlara gerek yok
Sonuçların amlaşılması kolay
Test edilecek antibiyotik listesi istenildiği gibi
belirlenir
Dezavantajlar;
Belirli bir grup bakteri için standardize
Sadece duyarlılık
kategorisini belirler, MİK sonucunu vermez
Difüzyon testleri
Gradyan Difüzyon Yöntemi (E-test)
Prensibi;
Plastik şeridin bir yönünde gradyan şeklinde
sabitlenmiş antibiyotiğin agar yüzeyine taşımasıdır Bu yöntem disk difüzyon testinin basitliği ile MİK düzeyi belirleme olanağı sağlar
Difüzyon testleri
Gradyan Difüzyon Yöntemi (E-test)
0.5 McFarland yoğunluk Mueller-Hinton agar
Takiben agar yüzeyine, belli bir antibiyotik gradienti içeren E-test şeritleri yerleştirilir
18-24 saat 35oC’de inkübe
Elips şeklindeki inhibisyon zonunun şerit ile kesiştiği noktadaki ilaç konsantrasyonu MİK değerini gösterir
