Karbapenemaz Üreten Klebsiella pneumoniae
Suşlarında bla
OXA-48-Benzeri Genlerin Araştırılması
Investigation of bla
OXA-48-Like Genes in Carbapenemase
Producing Klebsiella spp. Isolates
Elmas Pınar KAHRAMAN1, Hande TOPTAN1, Barış OTLU2, Mehmet KÖROĞLU1, Mustafa ALTINDİŞ1
1 Sakarya Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Sakarya.
1 Sakarya University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Sakarya, Turkey. 2 İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Malatya.
2 Inonu University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Malatya, Turkey.
ÖZ
Çok ilaca dirençli (ÇİD), geniş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) üreten, karbapenem dirençli Ente-robacteriaceae ailesi üyesi bakterilerin ortaya çıkışı ve yayılması dünya çapında bir sağlık sorunu haline gelmiştir. Ülkemizde karbapenem direncine neden olan blaKPC, blaNDM gen bölgelerine sporadik, blaOXA-48 gen bölgelerine ise endemik olarak rastlanmaktadır. Bu çalışmada, OXA-48 benzeri karbapenemaz üreten Klebsiella pneumoniae izolatlarında blaOXA-232, blaOXA-181, blaOXA-162, blaOXA-204, blaOXA-244, blaOXA-163,
bla-OXA-245 gen varlıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya dahil edilen izolatlar Sakarya Üniversitesi
Sakarya Eğitim Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı koleksiyonundan alınmıştır. Tanım-lama ve antibiyotik duyarlılık çalışmaları VITEK 2® otomatize sistemi (biomerieux, Fransa) ile, izolatların
karbapenemaz üretimi ise Modifiye Hodge Testi ile belirlenmiştir. Ayrıca, minimal inhibitör konsantras-yonu (MİK) değerleri, sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile incelenmiştir. blaOXA-48 benzeri gen bölgesini içeren izolatlar, konsensus primerler kullanılarak eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) yöntemi ile saptanmıştır. “Type-it HRM PCR” (Qiagen, Hilden, Almanya) kiti kullanılarak yapılan “High Resolution Melting Analysis (HRMA)” yönteminde erime sıcaklıkları (Tm) sapma gösteren izolatlar, OXA-48 varyan-tı şüphesiyle seçilmiştir. Bu izolatlarda hangi varyantların bulunduğunu belirlemek için dizi analizi (ABI 3500, Applied Biosystems, ABD) yapılmıştır. Karbapenemaz üreten K.pneumoniae izolatlarında imipenem MİK değerleri için VITEK 2® ve mikrodilüsyon yöntemi arasında %82, meropenem için %77, ertapenem
için %90 uyum saptanmıştır. Rt-PCR yöntemi ile 100 K.pneumoniae izolatının 45’inde blaOXA-48 benzeri gen bölgesi pozitif saptanmış, OXA-48 varyantlarını belirlemek için pozitif bulunan 45 izolat HRMA yön-temi ile değerlendirilmiştir. Sonrasında dizi analizi ile 41 (%91.2) izolatın aynı baz dizilimine sahip olan blaOXA-48/blaOXA-245 gen bölgelerini içerdiği, ikişer (%4.4) izolatın blaOXA-181 ve blaOXA-244 gen bölgelerini içerdiği tespit edilmiştir. Bu çalışma, ülkemizde blaOXA-48 benzeri gen bölgelerini en kapsamlı şekilde araş-tıran, OXA-181 ve OXA-244 pozitifliğinin saptandığı ilk çalışmadır. Çalışmamız sonucunda blaOXA-48 ve benzeri gen bölgeleri %45 oranında saptanırken bunların %4.4’ünün blaOXA-181 ve %4.4’ünün blaOXA-244 gen bölgelerini içerdiği bulunmuştur. blaOXA-48 benzeri gen bölgelerinin saptanması, kritik hasta grupla-rında antibiyotik seçiminde yol gösterici olacaktır.
Anahtar kelimeler: blaOXA-48 benzeri gen bölgesi; karbapenemaz; Klebsiella pneumoniae; yüksek çözünürlük-lü erime yöntemi; tek nükleotid polimorfizmi.
Geliş Tarihi (Received): 09.12.2018 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 23.01.2019
Makale Atıfı: Kahraman EP, Toptan H, Otlu B, Köroğlu M, Altındiş M. Karbapenemaz üreten Klebsiella pneumoniae
ABSTRACT
The emergence and spread of multi-drug-resistant (MDR), extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) producing carbapenem-resistant members of Enterobacteriaceae family has become a worldwide health problem. Carbapenem resistance caused by blaKPC, blaNDM gene regions are sporadic and blaOXA-48 gene region is endemic in our country. The aim of this study was to determine the presence of blaOXA-232, bla
O-XA-181, blaOXA-162, blaOXA-204, blaOXA-244, blaOXA-163, blaOXA-245 genes in OXA-48 like carbapenemase
produ-cing Klebsiella pneumoniae isolates. The isolates used in this study were provided from the Medical Micro-biology Laboratory collection of Sakarya University Sakarya Training and Research Hospital. Identification and antibiotic susceptibility tests were determined by the VITEK 2® automated system (biomerieux,
Fran-ce) and the carbapenemase production of isolates was determined by the modified Hodge test. Minimal inhibitor concentration (MIC) values were determined with broth microdilution method. The isolates containing the blaOXA-48-like gene region were identified by real-time polymerase chain reaction (Rt-PCR) method using consensus primers. In “High Resolution Melting Analysis (HRMA)” method carried out by using “Type-it HRM PCR” (Qiagen, Hilden, Germany) kit, isolates which showed a deviation in melting temperatures (Tm) were selected with the suspicion of OXA-48 variant. The sequence analysis (ABI 3500, Applied Biosystems, USA) was carried out to determine which variants were present in these isolates. Compatibility of MIC values was determined between VITEK 2® and the microdilution method with the
rate of 82% for imipenem, 77% for meropenem and 90% for ertapenem in carbapenemase-producing K. pneumoniae isolates. In 45 of 100 K.pneumoniae isolates, the blaOXA-48-like gene region was found to be positive by the Rt-PCR method. For the determination of OXA-48 variants, these 45 isolates were evalua-ted by HRMA method. The sequence analysis revealed that 41 (91.2%) isolates contained blaOXA-48/bla
O-XA-245 gene regions, while 2 (4.4%) isolates were found to contain blaOXA-181 gene regions and 2 (4.4%)
isolates were found to contain blaOXA-244 gene regions. This is the first study to determine OXA-48 and OXA-244 positivity in blaOXA-48-like gene regions in Turkey. As a result of this study, the OXA-48-like gene region was found to be 45%, of which 4.4% had blaOXA-181 and 4.4% had blaOXA-244 gene regions. The detection of blaOXA-48-like gene regions will guide for the selection of antibiotics in critical patient groups.
Keywords: blaOXA-48 like gene locus; carbapenemase; Klebsiella pneumonia; high resolution melting analy-sis; single nucleotide polymorphism.
GİRİŞ
Çok ilaca dirençli (ÇİD), geniş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) üreten karbapeneme dirençli Enterobacteriaceae ailesi üyesi bakterilerin ortaya çıkışı ve yayılması dünya çapında bir sağlık sorunu haline gelmiştir. Ayrıca bu bakteriler kullanılmakta olan antibiyotiklerin
etkinliklerine karşı da büyük bir tehdit oluşturmaktadır1-5. Karbapeneme dirençli ve ÇİD
gram negatif bakterilerin neden olduğu hayatı tehdit eden enfeksiyonlarda karbapenem-lerin kullanımı kısıtlanmaktadır6,7. Gram negatif bakteriler arasında karbapenem hidrolize edici enzimler olan karbapenemazların ortaya çıkışı hem toplum hem de hastane ortamı
için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır7. Karbapenemazlar; NDM (New Delhi
metallo-beta-laktamaz), VIM (Verona-integron mediated metallo-beta-laktamaz) ve IMP (imipenemaz) gibi metallo-beta-laktamazlar (MBL) ile serin karbapenemazlar (KPC “Klebsiella
pneumoni-ae carbapenemase” ve OXA tipi karbapenemazlar)’dan oluşmaktadır5.
Karbapenemaz üreten izolatların neden olduğu enfeksiyonlar gün geçtikçe
artmakta-dır. Ülkemizde karbapenem direncine neden olan blaKPC, blaNDM gen bölgelerine
spora-dik, blaOXA-48 gen bölgelerine ise endemik olarak rastlanmaktadır8. OXA-48 enzimlerinin
plazmid aracılığıyla aktarılması bakteriler arasında direncin hızlı bir şekilde yayılmasına
etkeni olduğu düşünülen izolatlarda taramalar yapılması gerekmektedir. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda, daha çok blaOXA-48 gen bölgeleri ile blaVIM, blaKPC, blaNDM, blaOXA-48, blaIMP gen bölgeleri ve birliktelikleri araştırılmıştır. Fakat karbapeneme dirençli olup bu gen bölgelerinin hiçbirinin bulunmadığı izolatlara da rastlanmaktadır. OXA-48 varyantla-rının araştırılması bu noktada gerekli olmaktadır.
Ülkemizin, OXA-48 tipi karbapenemazların en önemli rezervuarını oluşturan Kuzey Af-rika ülkeleri, Ortadoğu, Hindistan gibi bölgeler arasında yer alması nedeniyle bu gen
böl-gelerinin ülkemizdeki izolatlarda irdelenmesi gerekmektedir. blaOXA-48 benzeri gen
bölge-lerinden bazılarının araştırıldığı çalışmalar az sayıda olup, ülkemizde blaOXA-232, blaOXA-181, blaOXA-162, blaOXA-204, blaOXA-244, blaOXA-163, blaOXA-245 gen bölgelerinin tümünü araştıran bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada, karbapenemaz üreten K.pneumoniae izolat-larında OXA-48 varyantizolat-larından blaOXA-232, blaOXA-181, blaOXA-162, blaOXA-204, blaOXA-244, blaOXA-163, blaOXA-245 bölgelerinin tümünün araştırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Bu çalışma, Sakarya Üniversitesi Klinik Araştırmalar Girişimsel Olmayan Etik Kurulu onayı ile gerçekleştirildi (Tarih: 31.10.2016 ve Karar no: 174).
Çalışmaya, Sakarya Üniversitesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji La-boratuvarına farklı kliniklerden gönderilen hasta örneklerinden (kan, idrar, rektal sürüntü, balgam, trakeal aspirat, kateter, periton vb.) elde edilen 100 bakteri izolatı dahil edildi. Tüm izolatlar çalışılıncaya kadar boncuklu saklama besiyerinde -80°C’de saklandı.
Klinik örneklerden ilk izolasyon aşamasında üretilen bakterilerin tanımlama ve antibi-yotik duyarlılık testleri VITEK 2® (bioMerieux, Fransa) otomatize sistemi ile yapıldı. Daha sonra her bir izolatın imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerleri sıvı mikrodi-lüsyon yöntemi ile belirlendi. Dirençli ve duyarlı olma durumları EUCAST sınır değerlerine
göre yorumlandı10. İzolatların karbapenemaz üretimi, Modifiye Hodge Testi ile belirlendi.
Moleküler çalışmalar için bakteri süspansiyonlarından DNA ekstraksiyonu (QIAsym-phony DSP DNA Kits, Almanya) yapıldı. Tüm klinik örnekler için DNA miktarı ve kalitesi spektrofotometrik yöntem ile ölçüldü (Nanodrop Technologies Inc, Wilmington, ABD). Tüm örneklere ait saflaştırılmış DNA örnekleri üretici firmanın talimatları doğrultusunda Rotor Gene (Qiagen Inc.; Hilden, Almanya) cihazında Thermo Scientific™ Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Karışımı (2x) kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)’na tabi tutuldu. PCR protokolü ilk denatürasyon 94ºC’de 10 dk; denatürasyon 94ºC’de 30 sn, primer bağlanması 55ºC’de 30 sn, uzama 72ºC’de 1 dk olmak üzere 35 döngü ve son uzama 72ºC’de 10 dk olacak şekilde ayarlandı. Çalışmada, forward (5´-TTG GTG GCA TCG ATT ATC GG-3´) ve reverse (3’-GAG CAC TTC TTT TGT GAT GGC-5´) dizilerini içeren konsensus blaOXA-48 primerleri kullanıldı.
performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) saflaştırma yöntemiyle üretildi. Reaksiyon “Type-it HRM PCR” (Qiagen Inc.; Hilden, Almanya) k“Type-iti ile gerçekleştirildi. PCR karışımı, 12.5 μl master miks, 9.5 μl su, 1 μl ileri-1 μl revers primer, 1 μl kalıp DNA olarak hazırlandı. PCR protokolü ilk denatürasyon 95ºC’de 10 dk; denatürasyon 95ºC 10 sn, primer bağlanması 58ºC’de 15 sn, uzama 72ºC’de 10 sn olmak üzere 35 döngü gerçekleştirildi. Erime reak-siyonu ise 50°C’den 90°C’ye, saniyede 0.02°C’lik bir sıcaklık artışı olacak şekilde gerçek-leştirildi. Erime eğrisi grafikleri uMeltSM v2.0.2 yazılımı kullanılarak elde edildi.
HRMA yönteminde kullanılan primerler Şekil 1’de bulunan 108 baz çifti (bp) büyük-lüğünde olan gen bölgesi çoğaltılacak şekilde elde edildi. İlgili gen bölgeleri Sanger dizi analizi yöntemi (ABI 3500, Applied Biosystems, ABD) ile incelenerek OXA-48 varyantları belirlendi.
Gen bölgeleri ile suşların imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerleri ara-sında istatistiksel olarak anlamlı fark olup olmadığı One-Way ANOVA testi ile ölçüldü. Sonuçlar p< 0.05 bulunduğunda istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
Tablo I’de izolatların kliniklere ve klinik örneklere göre dağılımları görülmektedir. Kar-bapeneme dirençli K.pneumoniae izolatlarının en çok yoğun bakım ünitesinden
gönde-rilen örneklerden (%89) izole edildiği saptanmıştır. VITEK 2® otomatize sistemi ve
mik-rodilüsyon referans yöntemi ile yapılan antibiyotik duyarlılık testi sonuçları Tablo II’de verilmiştir.
Konsensus primer ile yapılan genel blaOXA-48 gen bölgesi taramasında 100 izolattan 45’i
pozitif bulunmuştur. Bu izolatlar varyantların ayrımı amacıyla HRMA yöntemiyle çalışılmış-tır. Elde edilen grafik Şekil 2’de gösterilmiştir. Şekil 2’de görülen üst üste binmiş tepe nok-taları aynı erime sıcaklığına sahip blaOXA-48/blaOXA-245 gen bölgesine sahip izolatları ifade et-mektedir. Bu eğri kümelerinden sapmalar varyantların varlığı hakkında ipucu veret-mektedir.
HRMA sonucunda elde edilen grafikte üç farklı Tm değeri dikkati çekmektedir. İlkinde
(~79.5°C) 41 izolat, ikincisinde (~79.9°C) iki izolat, üçüncüsünde (~80.4°C) iki izolat kümelenmiştir (Şekil 2).
Dizi analizi sonucunda elektroferogram görüntüleri ve dizilere ait fasta formatları yo-rumlanmıştır. Bulunan diziler NCBI Blast veritabanına kopyalanarak hangi gen bölgesine ait olduğu belirlenmiştir. Şekil 1’de görüldüğü gibi bizim değerlendirdiğimiz gen bölge-si için blaOXA-48/blaOXA-245 gen bölgelerinin baz dizileri birebir aynıdır. Bu nedenle bla O-XA-48 gen bölgesine ait dizilimi sağlayan izolatlarda ayrım yapılamadığı için izolat OXA-48/OXA-245 pozitif olarak değerlendirilmiştir. Yapılan değerlendirmeler sonucunda 41
Tablo I. İzolatların Kliniklere ve Klinik Örneklere Göre Dağılımları
Klinikler İzolat sayısı
Cerrahi 3
Çocuk Hastalıkları 1
Dahiliye 3
Enfeksiyon Hastalıkları 2
Gastroenteroloji 2
Yoğun Bakım Ünitesi 89
TOPLAM 100
Klinik Örnek Türü Sayı
Balgam 2 Yara 2 Rektal sürüntü 65 Kan 19 İdrar 9 Trakeal aspirat 3 TOPLAM 100
Tablo II. Antimikrobiyal Duyarlılık Sonuçlarının Sıvı Mikrodilüsyon Yöntemi ve VITEK 2® Otomatize Sistemi ile Karşılaştırılması
Yöntem Duyarlılık durumları İmipenem Meropenem Ertapenem
VITEK 2® otomatize sistemi S 6 7 2
I 54 5 3 R 40 88 95 Toplam 100 100 100 Sıvı mikrodilüsyon yöntemi S 2 2 3 I 53 18 4 R 45 80 93 Toplam 100 100 100
(%91.2) izolatın blaOXA-48/blaOXA-245, 2 (%4.4) izolatın blaOXA-181 ve 2 (%4.4) izolatın da blaOXA-244 gen bölgelerini içerdiği ve bu üç farklı varyantın yapmış olduğumuz HRMA çalışmasındaki farklı Tm değerleri ile korelasyon gösterdiği tespit edilmiştir. blaOXA-48/ blaOXA-245 aynı baz dizilerine sahiptir. blaOXA-181 blaOXA-48’den iki baz mutasyonu ile, bla-OXA-244 ise tek baz mutasyonu ile ayrılmaktadır. OXA-181 ve OXA-244 pozitifliği bulunan
suşlarla blaOXA-48 gen bölgesi üreten suşlar arasında One-Way ANOVA testi sonucunda
imipenem, meropenem ve ertapenem MİK değerleri arasında anlamlı bir farklılık bulun-mamıştır (p< 0.05, p= 0.6).
TARTIŞMA
Enterobacteriaceae türleri, özellikle Escherichia coli ve K.pneumoniae, sağlık bakımıyla
ilişkili ve toplum kaynaklı bakteriyel enfeksiyonların en önemli nedenleri arasındadır12.
Beta-laktam grubu antibiyotikler, bu enfeksiyonları tedavi etmek için kullanılan başlıca ilaç grubu olduğundan, bu ilaçlara karşı gelişen direnç tedavide önemli bir sorun oluş-turmaktadır. Diğer bir endişe, karbapenemlere karşı direnç gelişmesidir. Bu ilaçlar, ÇİD Enterobacteriaceae’nın neden olduğu enfeksiyonların tedavisinde son seçenek ilaçlar-dır13. Bundan dolayı karbapenem direnci, özellikle çeşitli karbapenemaz enzimlerinin üretimi vasıtasıyla bu ilaçlara karşı oluşan direnç son derece önemli olup, üzerinde cid-diyetle durulması gereken bir konudur. Karbapenemazlar başlıca; NDM (New Delhi me-tallo-beta-laktamaz), VIM (Verona-integron mediated metallo-beta-laktamaz) ve IMP (imipenemaz) gibi metallo-beta-laktamazlar (MBL) ve serin karbapenemazlardan (KPC
“K.pneumoniae carbapenemase” ve OXA tipi karbapenemazlardan) oluşmaktadır5.
OXA-48’den türemiş olan varyantlar dünyanın çeşitli bölgelerinde başlangıçta
K.pneumoniae’da, daha sonra diğer Enterobacteriaceae türlerinde tanımlanmıştır14. Bu
varyantlar OXA-48’den bir ile beş aminoasit mutasyonu ile ayrılmakta ve farklı
tam hidroliz spektrumu sergilemektedirler15. Son yıllardaki çalışmalar ve epidemiyolojik gözlemler, OXA-48 benzeri enzim üreten mikroorganizmaların birçok ülkede giderek daha fazla tanımlandığını göstermektedir.
Yıllarca neredeyse tüm OXA-48 üreten izolatların bildirimleri, Türkiye’de hastanede yatan ya da Türkiye ile bağlantılı hastalardan yapılmıştır16. bla
OXA-48 geninin tespitinden
sonra Gülmez ve arkadaşları17 tarafından yapılan bir çalışmada E.coli ve K.pneumoniae
izolatlarında çeşitli blaOXA-48-benzeri genlerin tespit edildiği bildirilmiştir. Pfeifer, Matten
ve Rabsch’in18 2009 yılında yaptıkları araştırmada bazı Enterobacteriaceae izolatlarında
blaOXA-162 geninin ortaya çıktığı bildirilmiştir.
Fattouha ve arkadaşları19, karbapenemaz üreten Enterobacteriaceae (KÜE)
izolatla-rında meropenem MİK sonuçları incelendiğinde, KPC üreten Enterobacteriaceae
izolat-larının %25’inin ve blaOXA-48-benzeri genleri taşıyan Enterobacteriaceae izolatlarının ise
%40’ının “Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)” sınır değerlerinin altında (MİK ≤ 1 μg/ml) olduğunu tespit etmişlerdir. Özellikle OXA-48 üreten izolatların bu rehbere göre belirlenen sınır değerlerin altında karbapenem MİK değerine sahip olması nedeniyle, karbapenemaz taramalarında tek bir rehberin evrensel olarak optimal tarama stratejilerine sahip olmasını beklemek mümkün görülmemektedir.
Ouertani ve arkadaşları20, 13 karbapenemaz üreten izolatta OXA-48 pozitifliğini %93,
OXA-204 pozitifliğini ise %7 olarak saptamışlardır. OXA-48 benzeri karbapenemazla-rın, Amerika Birleşik Devletleri (ABD)’nde Enterobacteriaceae üyelerinde son derece na-dir olduğu bilna-dirilmiştir. “Centers for Disease Control and Prevention (CDC)” verilerine göre, OXA-48 benzeri üreten KÜE izolatları, Ağustos 2015 itibariyle yalnız 19 eyalette
43 hastada tespit edilmiştir21. Brink ve arkadaşları22, K.pneumoniae izolatlarında %2.5
oranında OXA-48, %11.2 oranında OXA-181 pozitifliği tespit etmişlerdir. Lutgring ve
ar-kadaşları23, 30 adet KÜE izolatında OXA-181 (%43), OXA-232 (%33) ve OXA-48 (%23)
varyantlarını bulmuşlardır. Ülkemizde 2014-2015 yıllarında OXA-48 üreten izolatların en
yüksek epidemiyolojik seviyeye (Evre 5 “endemik durum”) sahip olduğu bildirilmiştir24.
Ülkemizde ilk OXA-48 benzeri izolat olan OXA-162, Kasap ve arkadaşları25 tarafından
2013 yılında yapılan analitik izoelektrik odaklama ve dizi analizi yöntemleriyle
tanımlan-mıştır. Ardından Baran ve Aksu’nun26 2016 yılında yaptıkları çalışmada, 181 KÜE
izolatı-nın %47.51’inde blaOXA-48 geni multipleks PCR ile tespit edilmiştir. Bunların %3.33’ünde
blaNDM-1 geni, %0.56’sında blaVIM geni pozitif bulunmuştur. İzolatların %49.72’sinde en az bir karbapenemaz kodlayan gen pozitif bulunmuştur. İzolatların dördünde, çoklu karbapenemaz genlerinin saptandığı bildirilmiştir. Ülkemizde yapılan bu ve diğer
çalış-malarda blaOXA-48 benzeri gen bölgelerinin ayrımı dizileme yöntemi ile irdelenmemiştir.
Bizim çalışmamızda ise, 100 adet karbapenemaz üreten K.pneumoniae izolatının %45’i blaOXA-48 benzeri gen bölgesi açısından pozitif bulunmuştur. Bu izolatların da
%91.2’si-nin aynı baz dizilimine sahip blaOXA-48/blaOXA-245, %4.4’ünün blaOXA-181 ve %4.4’ünün
çalışılan yöntem, gen bölgelerinin bulunduğu izolatlar, bölgelerin epidemiyolojileri, izo-latlar arasında klonal ilişki bulunup bulunmadığı gibi pek çok faktöre bağlıdır.
Bu çalışmada, HRMA ile tespit edilen izolatlardan dört tanesinin dizi analizi ile OXA-48 varyantı olduğu doğrulanmıştır. OXA-181 ve OXA-244 olarak belirlenen bu varyantların
Tm derecelerindeki farklılıklar OXA-181 için bir, OXA-244 için iki bölgede A-T arasındaki
ikili bağların G-C arasındaki üçlü bağa dönüşmesine bağlanmıştır. Varyantlardaki bu ami-noasit ikameleri Şekil 1’de gösterilmiştir.
Karbapenemaz üretimi moleküler olarak değerlendirilirken çoğunlukla OXA-48 gen bölgeleri ile VIM, KPC, NDM, IMP gen bölgeleri ve birliktelikleri araştırılmaktadır. Fa-kat karbapenemaz üreten ama bu gen bölgerinin hiçbirinin gösterilemediği izolatlara da rastlanmaktadır. Bazı laboratuvarlarda kullanılan moleküler teknikler uygun tasarlan-mamış primerler gibi nedenlerden dolayı OXA-48 varyantlarının gözden kaçabilmesine, dolayısıyla karbapenemaz üretiminin yanlış değerlendirilmesine neden olabilmektedir.
Bu çalışma, önce HRMA ile tarama, ardından dizi analizi ile karbapenemaz varlığının tespitinde varyantın belirlenmesi şeklinde planlanmıştır. Çalışmamız HRMA yönteminin, daha fazla sayıda örnek ve referans suşun çalışmaya dahil edilmesiyle optimize edilmesi halinde, dizi analizine gerek kalmadan OXA-48 varyantlarının tespitinde kullanılabilece-ğine işaret etmektedir.
Bu çalışmada, OXA-48 konsensus primerleri kullanarak Rt-PCR ile tarama sonucunda 100 karbapenemaz üreten K.pneumoniae izolatında %45 oranında OXA-48 pozitifliği
bulunmuştur. Çalışmamız, ülkemizde blaOXA-48-benzeri gen bölgelerini en kapsamlı
şe-kilde araştıran, OXA-181 ve OXA-244 pozitifliğinin saptandığı ilk çalışmalardan olması nedeniyle bilime katkı sağlayacaktır. HRMA yönteminin optimize edilmesiyle dizi anali-zine gerek olmadan özel hasta gruplarında ya da epidemiyolojik veri sağlamak amacıyla blaOXA-48-benzeri gen bölgelerinin saptanabilmesi mümkün olacaktır. blaOXA-48-benzeri gen bölgelerinin saptanması, kritik hasta gruplarında antibiyotik seçiminde yol gösterici olacaktır.
ÇIKAR ÇATIŞMASI
Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması bildirmemişlerdir. KAYNAKLAR
1. Zarrilli R, Giannouli M, Tomasone F, Triassi M, Tsakris A. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of an emerging problem in health care facilities. J Infect Dev Ctries 2009;3(5):335-41.
2. Nordmann P, Naas T, Poirel L. Global spread of carbapenemase producing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis 2011;17(10):1791-8.
3. Brink AJ, Coetzee J, Clay CG, Corcoran C, vanGreune J, Deetlefs JD, et al. The spread of carbapenem-resistant
Enterobacteriaceae in South Africa: risk factors for acquisition and prevention. S Afr Med J
4. Marchaim D, Perez F, Lee J, Bheemreedy S, Hujer AM, Rudin S, et al. “Swimming in resistance”: co-colonization with carbapenemresistant Enterobacteriaceae and Acinetobacter baumannii or Pseudomonas aeruginosa. Am J Infect Control 2012;40(9):1-6.
5. Bush K. Carbapenemases: partners in crime. J Glob Antimicrob Resist 2013;1(1):7-16.
6. El Gamal ML, Oh CH. Current status of carbapenem antibiotics. Curr Top Med Chem 2010;10(18):1882-97. 7. Patel G, Bonomo RA. “Stormy waters ahead”: global emergence of carbapenemases. Front Microbiol
2013;4(48):1-17.
8. Logan LK, Weinstein RA. The epidemiology of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: the impact and evolution of a global menace. J Infect Dis 2017;215(Suppl 1):28-36.
9. Nazik H, Poirel L, Nordmann P. Further identification of plasmid-mediated quinolone resistance determinant in
Enterobacteriaceae in Turkey. Antimicrob Agents Chemother 2005;49(5):2146-47.
10. EUCAST breakpoint table Version 8.1 (valid from 2018-05-15) available. Interpretation of MICs and zone diameters.
11. Hemarajata P, Yang S, Hindler JA, Humphries RM. Development of a novel real-time PCR assay with high-resolution melt analysis to detect and differentiate OXA-48-Like β-Lactamases in carbapenem-resistant
Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother 2015;59(9):5574-80.
12. Paterson DL. Resistance in gram-negative bacteria: Enterobacteriaceae. Am J Med 2006;119(6 Suppl 1):20-8. 13. Livermore DM, Woodford N. The beta-lactamase threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter.
Trends Microbiol 2006;14(9):413-20.
14. Poirel L, Heritier C, Tolun V, Nordmann P. Emergence of oxacillinase-mediated resistance to imipenem in
Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2004;48(1):15-22.
15. Dortet L, Oueslati S, Jeannot K, Tandé D, Naas T, Nordmann P. Genetic and biochemical characterization of OXA-405, an OXA-48-type extended-spectrum β-Lactamase without significant carbapenemase activity. Antimicrob Agents Chemother 2015;59(7):3823-8.
16. Aktas Z, Kayacan CB, Schneider I, Can B, Midilli K, Bauernfeind A. Carbapenem-hydrolyzing oxacillinase OXA-48 persists in Klebsiella pneumoniae in Istanbul, Turkey. Chemotherapy 2008;54(2):101-6.
17. Gulmez D, Woodford N, Palepou MFI, et al. Carbapenem-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates from Turkey with OXA-48-like carbapenemases and outer membrane protein loss. Int J Antimicrob Agent 2008;31(6):523-6.
18. Pfeifer Y, Matten J, Rabsch W. Salmonella enterica serovar Typhi with CTX-M β-lactamase, Germany. Emerg Infect Dis 2009;15(9):1533-5.
19. Fattouha R, Tijet N, McGeera A, Poutanena SM, Melanoa RG, Samir N. Patel SN. What Is the appropriate meropenem MIC for screening of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in low-prevalence settings? Antimicrob Agents Chemother 2016;60(3):1556-9.
20. Ouertani R, Ben Jomàa-Jemili M, Gharsa H, Limette A, Guillard T, Brasme L, et al. Prevalence of a new variant OXA-204 and OXA-48 carbapenemases plasmids encoded in Klebsiella pneumoniae clinical isolates in Tunisia. Microb Drug Resist 2018;24(2):142-9.
21. Lyman M, Walters M, Lonsway D, Rasheed K, Limbago B, Kallen A. Notes from the field: carbapenem-resistant
Enterobacteriaceae producing OXA-48-like carbapenemases United States, 2010-2015. MMWR Morb Mortal
Wkly Rep 2015;64(47):1315-6.
22. Brink AJ, Coetzee J, Corcoran C, Clay CG, Hari-Makkan D, Jacobson RK, et al. Emergence of OXA-48 and OXA-181 carbapenemases among Enterobacteriaceae in South Africa and evidence of in vivo selection of colistin resistance as a consequence of selective decontamination of the gastrointestinal tract. J Clin Microbiol 2013;51(1):369-72.
24. Albiger B, Glasner C, Struelens MJ, Grundmann H, Monnet DL, European survey of carbapenemase-producing
Enterobacteriaceae (EuSCAPE) working group. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Europe:
assessment by national experts from 38 countries. Euro Surveill 2015;20(45):pii=30062.
25. Kasap M, Torol S, Kolayli F, Dundar D, Vahaboglu H. OXA 162, a novel variant of OXA-48 displays extended hydrolytic activity towards imipenem, meropenem and doripenem. J Enzyme Inhib Med Chem 2013; 28(5): 990-6.
