ORIJINAL ARASTIRMA
RAT KARAClGER VE BOBREGlNDEN FERRlTlNlN KISM.i lZOLASYONU lLE ELDE EDlLEN SONUCLARIN DEGERLENDlRlLMESl
The evaluation of results obtained from the partial purification of ferritin in liver and kidney of rats
Turan Karayilanogiu1, Muzaffer Ku~ 1, U9ler Ktsa2, Tiirker Kutluay3, Levent Karaca3
Ozet: Ratlarm karaciger ve bobreklerinden demir depo proteini olan ferritini izole etmek amactyla ho- mojenizasyon, tst denaturasyonu, amonyum sUlfat presipitasyonu ve dializ i§lemleri yaptldt. Karaci- gerden % 22 verim ve 1.86 oranmda bir sajla§ttrma ile 39.4 nglmg protein ferritin izole edildi. Bobrek- ten ise % 24 verim ile 1.96 oramnda ve 6.25 nglmg protein ferritin safla§tlnldt. Ferritin oh;umu ir;in ELISA yontem kullamldt. Sonur; olarak rat karaci- gerinde ferritinin bObrege gore 6.3 kat daha fazla konsalltrasyonda oldugu saptandt.
Anahtar Kelimeler: Ferritin, Karaciger, Bobrek
F
erritin molekiil agrrhgt 450.000 dalton olan bir depo proteinidir. Her bir molekiilii 4000 kadar demir atomu ihtiva eder (6,11). Normal ~artlardatiim viicut demirinin % 25'ini kapsar ve b~hca kara- ciger, kemik iligi ve dalakta hiicre sitoplazmasmda
yogunla~mt~hr (4,15). 1956 ythnda Reissmann ve Dietrich akut karaciger harabiyeti saptanan hasta se- rumlannda ferritini saptaytp, dola~tmda mevcut fer- ritinin boya alan karaciger hiicrelerinden sahverildi- gini gosterdiler. 1972 yilmda Addison ve arkad~la
n ise serum ferritininin ol9iimii i9in immunoradio- metrik yontemi kullanarak, serum ferritini ile viicut depo demiri arasmdaki ili~kiyi a9tkladtlar (5,10).
1975 ve 1978'lerde Worwood, Linder ve Konijn fer- ritinin memeli karaciger, kalp ve bobreklerinden izo- lasyonunu ba~ardllar (13,14).
GATA. Etlik-ANKARA.
Biyokimya ve Klinik Biyokimya. Y.Do~;.Drl, Bil.Uzm.2, ProfDr.3
Erciyes Trp Dergisi 14 (4) 480-482,1992
Summary: Ferritin in liver and kidney of rats was partially purified, using homogenization, heat denaturation, amonium sulphate precipitation and dialysis. 39.4 ng ferritin per mg protein in liver was obtained with 22 % recovery. 6.25 ng ferritin per mg protein in kidney was obtained with 24 % recovery. The degree of purification was 1.86 and 1.94, respectively. The measurement of ferritin was used the method of ELISA. Our results showed that ferritin consantration in rat liver was 6.3 times higher than that in rat kidney.
Key Words: Ferritin, Liver, Kidney
Biz yapttg1m1z 9ah~mada ferritinin rat karaciger ve bobreklerindeki konsantrasyonunu saptamak ama- ctyla bu dokulardan ferritinin ktsmi izolasyonunu sagladtk ve Enzim Immunoassay yontemi ile kon- santrasyonunu belirledik.
METODLAR
Rat karaciger ve bObreginden ktsmi ferritin izolasyo- nunu saglamak amactyla, 91kar1lan karaciger ve bOb- rek saf su ile ytkamp kanlarmdan anttldtktan sonra agtrhklan belirlendi ve ayn olarak safla~trrma saf- halarmdan ge9irildi. <;ah~mamtzda ferritinin doku- lardan ktsmen safla~tmlmast ivin Penders yontemi modifiye edilerek uygulandt (8).
Homojenizasyon: Karaciger (24.18 g) ve bobrek (5.819 g) aguhgmm 5 kat1 su ile sulandmlarak
"Thermovac lndustres" homojenizatorii ile 10 000 devir/dakika htzda 5 dakika homojenize edildi.
480
Karayzlanoglu, Ku§, K1sa ve ark.
1st Denatarasyonu: Homojenat 70-75 °C'de ben- maride 10 dakika tStl.lldt ve buz ic;:erisinde so~utulup
30 dakika stire 25 000 xg'de santriftij (IEC Model 2K Centrifuge) edildi. Elde edilen stipematan 4 °C'de 24 saat bekletildi.
Tuz Fraksiyonasyonu: Stipernatanm pH't 5.5'a katt sodyum asetat ile ayarlandtktan sonra, % 55 sattiras- yon sa~layacak miktarda amonyum stilfat (2.35 moi/L) eklendi. 4 °C'de 14 saat beklettikten sonra, 2 saat 40 000 xg'de santriftij edilerek ferritinin presipi- tasyonu sa~lan<h.
Dializ: 15 mmol/L fosfat soltisyonunda c;:oztinmesi
sa~lanan presipitat PEG ile dializ edildi.
Safla~l.lrmanm her safhasmda ahnan numunelerde protein ve ferritin miktar tayini yaptl<h. Protein mik- tar tayini ic;:in Bradford yontemi (9), ferritin ic;:in ise ELlSA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) yontemi (10) (Eurogenetics-Diagnostic kit) uygulan- dt. Bu olc;:timler ic;:in Shimadzu (UV-120-01) spekt- rofotometresi ve El 312'e bio-kinetics reader (Bio- Tek Ins.) cihazt kullaniidt.
BULGULAR
Ratlardan usultine uygun olarak ahnan karaci~er ve bObrekten ferritinin safla~tmlmast i~leminde elde edilen homojenat, 25 000 xg sUpernatant amonyum stilfat kesiti ve dializatta total protein ve ferritin mik- tarlart Tablo 1 ve Tablo 2'de gosterilmi§tir. Bu bul- gular esas ahnarak verim ve safla~llrma orant belir- lendi.
Dokulardan ferritini izole etme basamaklannda elde edilen fraksiyonlardaki verim ve safla§ma oranlanm hesaplamak ic;:in ferritin ve total protein miktar tayin- leri yaptldt. Verim, herhangi bir fraksiyondaki total ferritin miktan ile ilk fraksiyondaki ferritin konsant- rasyonu arasmdaki ytizde oran ile safla§ttrma katsa- YlSl ile miligram protein ba~ma dti~en ferritin kon- santrasyonlar• arasmdaki oran hesabt ile elde edildi (4).
TARTI~MA
Rat karaci~er ve bObre~inden ferritin isolasyonu amactyla alman organlar homojenize edildikten son- ra ISI denattirasyonu amonyum stilfat presipitasyonu ve dializ safhalarmdan gec;:iri1di. Bu safla~trrma da Penders yontemi santriftigasyon zamam, htzt ve amonyum stilfat konsantrasyonunda bazt de~i~iklik
ler yapiiarak aynen uygulandt (8). Whittaker tavuk karacigerinden ferritini tuz fraksiyonasyonu sonu- cunda ba~langtc;: konsantrasyonunun 3.7 katt olarak izole etmi~ti (12). Bizim c;:ah~mamtzda isc br:-~ci
~erde 0.86, oobrekte ise 0.94 kat dcgcrinck frrritin izole edildi. Alman verim ise karaci~crde % 22, bul>- rekte ise % 24 civanndaydt. Worwood, Puv.c:ll \ c:
Massower yapttklan c;:ah~mada ferritinin karacig,·r de daha fazla yogunla~tt~mt gostcnni~Icrdi
(7 ,9,13). <;ah~mamtzda rat karaci~erinde ferritin 46.1 ng/mg protein konsantrasyonunda, b6brekte isc 6.59 ng/mg protein olarak saptand1. Bu Worwood ve Powell'in bulgulartyla uyum gosterdi. Penders'in yonteminde ferritin presipitasyonu ic;:in amonyum stilfat belirli bir satiirasyon saglayacak miktarda 2 kez kullamlmt§tl. Biz aym sattirasyonu bir defada
sa~ladtk.
Tablo 1. Rat karacigerinden ferritinin safl~tmlmasJ basamaklarmda ele ge9en fon.ksiyonlardaki ferritin ve protein degerleri
Hacim T.Protein Ferritin Ferritin Verim Safla§ma
ml mg/ml mg/ml ng/ml Protein % (kat)
Homojenat 98 32.50 15.3 46.1 100 1.00
*1499.4
25 000 xg siipernatam 90 30.30 14.1 41.8 85 1.90
*1269.0
(NH4)2 S04 siipernatam 65 7.16 3.0 27.2 13 1.59
*195.0
Dializat 27 8.63 12.6 39.4 22 1.86
*340.2
*Total ferritin miktan
481 Erciyes Ttp Dergisi 14 (4) 480-482,1992
Rat karaciger ve bObregindenferritinin ktsml izolasyonu ile elde edilen sonuflann degerlendirilmesi
Tablo 2. Rat bobreginden tuz fraksiyonasyonu sonucu elde edilen ferritinin safla§tmlma oranlan
Hacim T.Protein Ferritin Ferritin Verim Safla§ma
ml mg/ml mg/ml ng/ml Protein % (kat)
Homojenat 24 30.5 8.4 6.59 100 1.00
*201.6
25 000 xg supernatant 21 30.1 9.2 6.41 95 1.97
*193.2 (NH4)2 S04 siipernatan1 20 5.8
Dializat 12 7.86
*Total ferritin miktan
Sonu9 olarak;
a. Ratlarda ferritinin karacigerde, bObrege g<>re daha fazla konsantrasyonda oldugu,
b. Ferritin presipitasyonu i9in amonyum siilfat yerine daha ctkili olacak ba~ka bir maddenin kullamlmast gerektigi,
c. Ferritinin purifikasyonu ir,:in kullandlgtmtz Pen- KAYNAKLAR
I. Anderson MG, Kelly AM: Serum ferritin by a rapid and inexpensive ELISA method. Clin Chem Acta 116:405-8.1982.
2. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of milligram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254,1976.
3. Conradie JD, Mohele BEL: Quantitation of Serum ferritin by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Med J 57:282-7,1980.
4. Giannoulis E. Arvanitakis C, Nikopoulos A:
diagnostic value of serum ferritin in primary hepa- tocellular carcinoma. Digestion 30:236-241,1984.
5. Halliday JW, Gera KL, Powell LW: Solid phase radio-immunoassay for serum ferritin. Clinica Chimica Acta 58:207-214,1975.
6. Mejia LA, Viteri FE: ferritin concentrations in plasma form capillary blood and venous blood compared. Clin Chim 2915:871-873,1983.
7. Massover WH: Molecular size heterogeneity of ferritin in mouse liver. Biochem Biophys Acta 829:
377-386.1985.
8. Penders TJ, Rooij Hf-1, Leiynse B: Rapid isolation of ferritin. Biochem Biophys Acta 168:588-590, 1968.
Erciyes Tzp Dergisi 14 (4) 480-482,1992
2.4 8.27 25 2.25
*48
4.1 6.25 24 1.94
*49.2
ders yonteminin zaman ahct oldugu, olr,:iimii ir,:in kullamlan ELlSA yonteminin ise Anderson'un ileri siirdugu gibi (1), basit ve bsa zamanda sonw;:Ianan bir ol<,:iim oldugu,
d. Bu r,:all~ma ile saptanan doku ferritin diizeylerinin serum ve doku demir (Fe) konsantrasyonlan ile ili~
kisinin ar~tmlmasi gerektigi kan1sma vanldl.
9. Powell LW, Halliday JW, Cowlishaw JL: Relationship between serum ferritin and total body iron stores in idiopathic haemochromatosis. Gut 19:538-542,1978.
10. Saab GA, Green R, Crosby WH: Rapid assay for measurement of serum ferritin. Am J Clin Pathol 70:275-9,1978.
11. Von Oost BA, Beld BV, C/oin LG: Measurement of ferritin in serum: Application in Diagnostic Use.
Clin Biochem 17:263-269,1984.
12. Whittaker D, Torrance JD, Kew MC: Isolation of ferritin from human hepatocellu/er carcinoma.
Scand J Haemato/33:432-439,1984.
13. Worwood M, Aherne W, Dawkins S, Jacobs A:
The characteristics of ferritin from human tissues, serum and blood cells. Clin Sci Mol Med 48:441- 451,1975.
14. Worwood M, Dawkins S, Wagstaff M: The purification and properties of ferritin from human serum. BiochemJ 157:97-103,1976.
15. Zuyderhoudt FM, Linthorst C: The microhetero geneity of human liver and serum ferritins measured on minute amounts of ferritin in crude samples. Ann Clin Biochem 21:471-476,1984.
482
